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人白介素 |
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此我们拟采用原代培养的骨骼肌做为靶细胞转入IL2基因，希望通过其能分泌细胞因子达到治疗肿瘤的目的，为肿瘤的基因治疗提供新途径。
材料和方法
1. pGEM-3zf(+)-IL2多克隆载体的构建
用限制性内切酶PstI酶切pGEM-3zf(+)质粒(购自华美生物工程公司)，与纯化的1.0kbh-IL2 cDNA片段(两端pstI酶切，由美国Michigan大学医学中心Thompson CB教授惠赠)，用T4连接酶(华美生物工程公司)连接；转化感受态菌DH5α或JM109，将细菌涂布于含X-gal和IPTG的平板上进行蓝/白斑筛选，酶切鉴定阳性克隆(图1)。重组质粒的提取、纯化、酶切、片段回收、连接及大肠杆菌感受态制备均参见文献［5］。
2. 真核表达载体pCMV-IL2构建
用pCMV-LacZ质粒(美国Wisconsin大学Waisman中心惠赠)，经限制性内切酶HindⅢ、EcoR Ⅰ(华美生物工程公司)双酶切，去掉3.0kb的LacZ基因，回收含CMV启动子的4.3kb片段；pGEM-3zf(+)-IL2经相同双酶切处理，提取其中1.0kb的h-IL2cDNA片段，与含有CMV启动子的DNA片段经T4连接酶连接，建成pCMV-IL2真核载体(图2)。
图1 多克隆载体pGEM-IL2构建示意图
Fig.1 Construction of recombinant vector pGEM-IL2.
图2 表达载体pCMV-IL2构建示意图
Fig.2 Construction of eukaryotic expression vector pCMV-IL2.
3. 真核表达载体pRSV-IL2的构建
将pRSV-LacZ质粒(美国Wisconsin大学Waisman中心惠赠)，经限制性内切酶HindⅢ、pvuⅡ(华美生物工程公司)酶切，去除其中的LacZ基因，回收其中含有RSV启动子的4.0kb基因片段；将pGEM3zf(+)-IL2经HindⅢ、HincⅡ(华美生物工程公司)双酶切，回收其中1.0kb h-IL2 cDNA片段，与RSV启动子经T4连接酶连接，构建pRSV-IL2真核载体(图3)。
图3 表达载体pRSV-IL2构建示意图
Fig.3 Construction of eukaryotic expression vector pRSV-IL2
4. 原代骨骼肌的培养
取新生2～5d的SD大鼠的四肢骨骼肌组织，剪成肉糜后用胰蛋白酶(1∶250，Sigma)和胶原酶(Gibco/BRL)消化，制成细胞悬液并用20μm孔径的滤膜过滤去除组织碎块，所得悬液用Percoll(Sigma)进行密度梯度离心，得出纯化干细胞以5×105细胞密度在35mm平皿内进行原代培养。培养基含5%鸡胚浸出液(Gibco/BRL)、15%马血清(天津血研所)、和80%MEM(Gibco/BRL)。前3d每日换液，以后隔日换液。
5. Lipofectin介导的基因转移
将质粒pCMV-IL2、pRSV-IL2以及作为阳性对照的质粒pRSV-LacZ与Lipofectin分别用无血清培养基(Opti-MEM)稀释至0.75ml，然后逐滴混匀，形成DNA-Lipofectin复合物；将培养2～3d的原代骨骼肌细胞用无血清培养基洗3次后加入DNA-Lipofectin复合物，在37℃、5%CO2条件下放置4～6h，经10%DMSO冲击后，加入完全培养基，继续培养2～3d。
6. ABC免疫组织化学法检测人白介素-2的表达
将35mm平皿取出，对其中培养的转基因后细胞进行免疫组织化学染色，以PBS(0.01mol/L pH7.4)洗2次，用5%戊二醛固定5～10min，以PBS洗(5min×3)。加入含0.1% Triton X-100和1.5%正常马血清的PBS缓冲液，室温下振荡孵育30min，移入鼠抗人白介素-2单克隆抗体(1∶100，购自军事医学科学院)中4℃孵育24h，PBS洗(5min×3)。加入ABC复合物(1∶50)，37℃孵育30min，0.05mol/L Tris.HCl缓冲液洗(5min×3)，加入含0.上一页 [1] [2] [3] 下一页
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