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用荧光原位杂交方法检测肺癌印片标本中性染色体数目的异常 |
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位年龄为60岁(35～72岁)。病理诊断结果为：鳞癌9例，腺癌4例，小细胞肺癌2例，肺泡癌1例(表3)。取无杂质，无明显坏死，呈鱼肉状的新鲜癌组织块，用手术刀切出约1 cm2左右的横断面。取干净的载玻片在断面处轻轻接触，制成印片(touch preparation)。室温晾干后，入甲醇：乙酸液(3∶1)室温固定20min，共固定3次，经PBS洗后，室温晾干，于-20℃储存备用。
2.正常人外周血淋巴细胞染色体的制备
取6例正常人(男性3例，女性3例)外周血各0.5ml，参照文献［4］按照常规细胞遗传学方法制备染色体。即将上述0.5ml血在加有植物血凝素(PHA)(Boehringer Mannheim公司，Germany)的5ml RPMI 1640培养基中培养72h，终止培养前2h，加入秋水仙胺(colcemid)(Fluka公司，Switzerland)至终浓度0.04mg/L，继续培养。离心收集细胞，用0.075mol/L KCl 37℃低渗10min，甲醇：乙酸液(3∶1)固定3次，每次20min，高位湿冷滴片，晾干，-20℃保存备用。
3.探针的标记
人X、Y染色体特异探针均购自ATCC公司(American Type Culture Collection)。人X染色体特异探针以FluoroRedTM(Rhodamine-4-dUTP,Amersham公司，UK)标记，杂交后显红色信号，人Y染色体特异探针以FluoroGreenTM(Fluorescein-11-dUTP,Amersham公司，UK)标记，杂交后显绿色信号。标记采用缺口翻译方法(nick translaton labelling systemTM,GIBCO/BRL)进行，标记后的探针大小在300到800 bp左右。
4.荧光原位杂交
参照文献［5］并加以改进。肺癌印片或外周血淋巴细胞染色体片经70%乙酸、PBS洗后，70%、90%、100%乙醇脱水，50%甲酰胺-2×SSC中于75℃变性3min，过冷梯度(70%、90%、100%)乙醇，晾干后与经75℃变性过的X、Y染色体探针的混合物杂交(湿盒中37℃过液)。杂交完毕后，经42℃的50%甲酰胺-2×SSC和2×SSC洗，乙醇脱水。DAPI-防褪色液封片。
5.结果观察
用Nikon荧光显微镜配以三色滤光片(FITC/Texas Red/DAPI)观察。每一标本在镜下选择4～5个区域连续计数300～500个细胞中红色杂交信号(X染色体)和绿色杂交信号(Y染色体)的数目，并计算具有各杂交信号的细胞占总计数细胞的百分比。破碎，边缘不清，重叠及杂交信号无法辨认的细胞不计数在内。杂交信号的判定标准参照文献［6］。杂交结果以Kodak ASA400彩色负片摄片。
结果和讨论
1.对照研究
X、Y探针与正常细胞杂交以确定探针杂交的特异性(图1)。由于技术上和生物学上的原因，即使是正常细胞染色体，其杂交结果也不可能100%都是2倍体，为了消除这一误差并给肺癌印片标本中判定X、Y染色体拷贝数增加或减少提供一个标准，我们用X、Y探针与3例男性及3例女性正常外周血淋巴细胞杂交，结果见表1，2。计算出其99%可信限(上限)作为结果判定的标准，即在女性患者中具有≤1个X染色体杂交信号的细胞占≥6.98%时视为丢失，具有≥3个X染色体杂交信号的细胞占≥3.32%时视为染色体拷贝数增多；男性患者中，对X染色体，具有0个杂交信号的细胞占≥3.64%时视为丢失，具有≥2个杂交信号的细胞占≥5.05%时视为拷贝数增多，对Y染色体，具有0个信号的细胞占≥2.15%时视为丢失，≥2个杂交信号的细胞占≥1.19%时视为拷贝数增多。因为印片中细胞的成分比较复杂，参考相关文献［7］我们将上述标准提高到10%。以增加结果判定的严格性。
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