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P53融合蛋白的原核表达及其单克隆抗体的制备 |
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］。正常P53蛋白半衰期短不能用IHC法检测出，而突变的P53蛋白因半衰期延长而导致P53蛋白在细胞中的累积，很容易用IHC法检测出［2］。Barnes等［3］对1千多例组织学标本进行了回顾性研究，发现有40%以上的恶性肿瘤组织能见到P53阳性染色，进一步研究发现肿瘤组织中P53高度表达的患者其预后差。因此，用IHC法检测肿瘤组织内P53蛋白表达，早期制定合理治疗方案，将有助于改善患者的预后。制备特异性强、亲和力好的抗体为检测突变的P53蛋白提供了基本保证。我们就P53cDNA的扩增、重组、表达、单抗的制备及在组织化学检测中的结果报告如下。
材料和方法
1.P53-PGEx-2T重组质粒的构建
根据人P53cDNA序列，设计两个分别带有BamHI和EcoRI酶切位点能扩增编码N-端180个氨基酸cDNA的引物，P53上游引物：5′ AACGGATCCATGTGCAATACCACCATG3′，下游引物5′ACGAATTCACCAGATAATTCATCTGA3′，PCR扩增条件为：95℃变性5min，94℃变性45s，48℃退火1min30s，72℃延伸1min30s(3个循环)，94℃变性45s,56℃退火1min30s, 72℃延伸1min 30s(30个循环)，72℃延伸10 min; 4℃冰浴。获得相应的cDNA片段，将该片段分别用BamHI/EcoRI消化，根据阅读框架，将其克隆在经酶切(BamHI/EcoRI)的PGEX-2T表达质粒中(图1)。
图1 P53cDNA片段的PCR扩增及克隆
Fig.1 The amplification by PCR and the cloning of P53 cDNA fragment
2.感受态细胞制备及重组质粒的转化
将冻存于-70℃的JM109菌复苏划LB板37℃过夜，次日挑选单一菌落于LB培养液中37℃振荡培养，待菌液OD600为0.2～0.6h,5 000r/min离心10min，沉淀用1/2培养体积的4℃25m mol/LCaCl2悬浮，冰浴30min后离心10min，沉淀用1/10培养体积的预冷CaCl2混悬，冰浴40min，备用。将50ng重组质粒P53-PGEX-2T和0.1ml感受态JM109混合，置于冰上30min，转入42℃水浴2min，加入37℃预温的LB0.9ml，37℃缓慢轻摇45min，接种到含有氨苄青霉素的LB(LB/Amp+)培养皿中，37℃过夜。
3.融合蛋白的制备及特性鉴定
挑选几个上述LB/Amp+板中的单个菌落分别置于LB/Amp+培养液中，37℃250r/min振摇培养至OD600约1h，加入IPTG诱导(终浓度为0.5mol/L)，不加入IPTG者为阴性对照，继续振摇1～2h。经SDS-PAGE后，将表达融合蛋白的菌落用微量碱变性法提取DNA，进行酶谱分析。提纯重组质粒P53-PGEX-2T，再进行转化、诱导，挑选表达融合蛋白量多者，进行大量扩增诱导、离心，用含1%Triton X-100的溶菌酶裂解细菌、超声破碎，取其少量及离心后的沉淀、上清行SDS-PAGE，确定融合蛋白的溶解性；大量裂解液行SDS-PAGE，用预冷的0.1mol/L KCl染色，切下融合蛋白带，电洗脱过夜，收集蛋白液，PEG浓缩，PBS透析，以BSA为标准，确定P53蛋白量。用间接ELISA法测定此融合蛋白与进口单抗DO1、PAB1801反应性。
4.抗P53蛋白单抗的制备
用P53-GST融合蛋白为免疫原，免疫6～8周龄BALB/c小鼠3次，每次50μg/只鼠。末次免疫1月后，腹腔注射融合蛋白50μg/鼠，3d后取脾制成细胞悬液与SP2/0细胞常规融合。分别用融合蛋白P21-GST及P53-GST包被酶标板，间接ELISA法双筛挑选与P53-GST强阳性而与P21-GST不反应的细胞上清再行IHC染色，将IHC染色阳性孔的细胞进行克隆，待细胞分泌抗体的能力稳定之后，制备小鼠腹水；并用间接ELISA法对抗体亚类进行测定。
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