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去甲斑蝥素诱导人肝癌BEL |
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去甲斑蝥素(norcantharidine, NCTD)为全人工合成的一种抗癌活性成分，与中药抗癌活性成分斑蝥素(cantharidine, CA)相比，缺少1，2位的两个甲基，立体构型相同［1，2］。去甲斑蝥素克服了斑蝥素刺激泌尿系统的副作用，临床上用于治疗多种消化道肿瘤，以原发性肝癌为主，显示了较好疗效［3，4］。作为抗癌药物，去甲斑蝥素不同于其他化疗药物之处在于它对正常骨髓细胞不但没有抑制作用，反而有很好的刺激其生长效应［5，6］，抗癌机理颇为独特。我们在实验中发现去甲斑蝥素能够诱导人肝癌BEL-7402细胞凋亡，进一步研究这一现象，对揭示去甲斑蝥素的抗癌机制及指导其临床应用等有重要意义。
材料和方法
1.细胞系及培养条件
人肝癌BEL-7402细胞系(中日友好临床医学研究所细胞生物室冻存)接种于含20%小牛血清及100IU/ml青霉素和100IU/ml链霉素的RPMI-1640培养液中，在37℃、含5%CO2的培养箱内培养传代。加药均在细胞对数生长期内进行。
2.药品与试剂
去甲斑蝥素(北京第四制药厂王广生教授惠赠)，在RPMI-1640内溶解，抽滤灭菌，-20℃保存。RNaseA和Proteinase K(E Merck)按分子克隆操作指南［7］分别配成10g/L和20g/L,-20℃存放。
3.剂量反应曲线
按参考文献［8］，取培养的肝癌细胞，以4×104/ml的密度接种于96孔板，每孔180μl。待细胞贴壁后，各孔继加20μl不同浓度的待试药物，每个稀释度作8个平行孔。置含5%CO2的37℃培养箱中培养48h。倒出培养液，生理盐水洗3次，每孔加入NAG酶反应底物保存液50μl，37℃继续孵育4h后，每孔再加入80μl酶反应终止液，立即置日本NJ-2000型酶标仪中测定各孔的OD值(检测波长405nm，参比波长490nm)。以不同浓度药物作用的培养孔的平均OD值对药物浓度作图，实验重复3次。
4.细胞DNA片断的提取及琼脂糖凝胶电泳
参照文献［9］收集DNA片段，在1.0%的琼脂糖凝胶上电泳，恒压33V；紫外透射仪上观察并摄片。
5.细胞形态学观察
5.1 一般形态学观察：收集适量细胞，离心涂片，风干固定。贴壁细胞，直接倒掉培养液，取出细胞附着的盖片，PBS洗。单层细胞标本以Wright-Giemsa染色，光镜下观察。
5.2 超微结构观察：细胞经常规2.5%戊二醛与1%锇酸固定后，逐级浓度酒精脱水，Spury Resin树脂包埋，超薄切片，枸橼酸铅-醋酸双氧铀电子染色，JEM-1200EX透射电镜观察。
6.免疫细胞化学法检测凋亡相关蛋白的表达
常规SABC法测定。用PLP(过碘酸盐-赖氨酸-多聚甲醛)固定液固定细胞，一抗为兔抗人Bcl-2(1∶50, Santa Cruz Biotechnology, Inc),湿盒中4℃冰箱过夜。滴加生物素化二抗(1∶200, Vector laboratories, Inc)，室温30min，滴加辣根酶标记链霉亲和素(1∶400, Vector laboratories, Inc)，室温30min，DAB显色。结果经LEITZ DMRBE型显微分光光度计(Leica)定量：每组取3～5张有代表性的标本，随机框取90个细胞测定其平均光密度，结果用t检验统计分析。
7.Western blotting分析
离心收集细胞约5×106个，加入100μl 2×点样缓冲液，沸水中煮10min，使细胞裂解，每个点样孔加25μl样品液，12.5%的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质。凝胶上的蛋白带转移到硝酸纤维素膜上，封闭液封闭膜上的免疫球蛋白结合位点，过夜。加入特异性的一抗(兔抗Bcl-2，1∶1 000)、生物素化二抗(1∶2 000)及辣根酶标记链霉亲和素(1∶2 000)，DAB显色。
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