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干燥，PBS冲洗3次，每次3～5min ×3次，3%过氧化氢溶液室温下孵育10min，PBS冲洗，5min×3次，加50μl 10%非免疫性动物血清，室温下孵育10min，吸去多余液体，加入50μl一抗(抗Bcl-2多克隆抗体，北京中山公司)4℃过液，一抗稀释度为1：20，PBS冲洗，5min×3次，加入50μl生物素标记的二抗，室温下孵育10min,PBS冲洗，5min×3次，加入50μl链亲和素-过氧化物酶溶液，室温下孵育10min，PBS冲洗5min×3次，100μl新鲜配制的DAB-H2O2溶液，显色3～10min，显微镜观察，待显色完成后用自来水冲洗3min，苏木素复染，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。
3.2 形态计量学方法：每组标本测定3张切片，每张切片测定多个视野，以视野数为单位(n值)，分别为：24h实验组n=12，对照组n=9;48h实验组n=10，对照组n=10；每张切片的多个视野共测50个细胞，3张切片总计150个细胞，用Quantimet 520+图像分析仪(德国)进行测量，选择OD值(平均光密度值)为定量参数。
3.3 统计学处理：检测结果以表示，采用两均数间比较的t检验。
实验分组：正常对照组(control)
UV-C照射组(UV-C)
结 果
1.体外SMC培养
参照传统的组织贴块法进行体外SMC培养，所得细胞生长状态具典型“峰与谷”结构，SP免疫组织化学方法观察细胞内α-SM Actin表达阳性，证明所得细胞为SMC。
2.UV-C诱导体外SMC凋亡及其检测
2.1 形态学变化：应用常规细胞培养超净台紫外消毒灯(20W、220V、50Hz)所发射的紫外光源UV-C(254nm)垂直照射距离其10cm处的SMC10min后，约3h细胞体积开始缩小，12h部分细胞变圆、上浮，随时间推移上浮细胞渐增多，24h将爬片生长的细胞经HE染色，光镜下观察可见：细胞体积变小、胞质收缩、深染，核染色质浓缩，聚集于核膜下呈镜界分明的颗粒块状小体，细胞形态完整；48h可见多数细胞表现同24h，亦可见部分细胞膜出泡；72h时可见细胞膜包裹碎裂的核成为凋亡小体。(图2～5)。
上述形态学变化发生之后，进一步检测其生化指标。
2.2 生化指标检测：于UV-C照射后24h、48h分别提取细胞总DNA进行琼脂糖凝胶电泳，结果见图1。可见经UV-C照射后24h、48h的细胞DNA图谱为180～200bp的亚单位片断及其倍数的片断，呈梯状(ladder)，未经处理的正常细胞其DNA图谱不呈现梯状带。说明经UV-C照射后SMC DNA在核小体联接部发生了断裂。
图1 SMC DNA图谱
1.UV-C照射后24h 2.正常对照组 3.UV-C照射后48h 4.分子量Mark
(Hinf 切割 pBR322,1,632;517;506;396;344;298;221;220;154bp)
Fig.1 SMC DNA Ladder
3.UV-C诱导的凋亡SMC内Bcl-2蛋白表达的研究
3.1 免疫组织化学染色观察：光镜下，正常SMC Bcl-2在胞浆中成片均匀表达，核周表达增强，可呈环状或块状围绕胞核，核内表达阴性；照后24h、48h凋亡SMC胞浆中Bcl-2均匀弱表达，核内阳性表达，呈块状或半月状增强。说明UV-C可导致SMC胞浆内Bcl-2表达下降和胞浆内Bcl-2的迁移和再分布入核。(图6，7)
3.2 形态计量学观察：正常、经UV-C照射10min后24h、48h大鼠主动脉SMC内bcl-2基因表达的平均光密度值变化见附表。
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