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蝌蚪提取液诱导HL60细胞分化和凋亡的实验研究 |
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ngly related to Bcl-2 protein.
【Key Words】 Extract of tadpole: HL60 cell; Differentiation; Apoptosis
白血病是增殖分化异常性疾病。HL60细胞是目前体外研究白血病细胞分化的良好的模型，已知蝌蚪提取液(T871)能诱导小鼠红白血病细胞向良性方向转化［1］，为进一步了解T-871的抗肿瘤作用，本研究观察了T8712诱导HL60细胞发生分化和凋亡的作用。
材料和方法
1.材料
1.1 人早幼粒白血病细胞(HL60)引自河南医科大学微生物学和免疫学教研室。用含有10%胎牛血清的RPMI1640培养基培养(内含青霉素105IU/L，链霉素105IU/L，谷氨酰胺2mol/L)。临用前用8%NaHCO3调pH值至7.0～7.2，37℃，饱和湿度，5%CO2条件下悬浮培养。
1.2 蝌蚪提取液的制备：取池塘黑色有尾无腿的活蝌蚪(经鉴定为河蛙蝌蚪)，洗净、晾干、称重，蒸馏水浸泡48h后，用醚提取法［2］制成蝌蚪提取液(以下简称T8712)。其浓度为1ml相当于1g干重蝌蚪。-25℃保存备用。
1.3 Bcl-2多抗：美国Santa Cruz
2.实验方法
2.1 取对数生长期HL60细胞，以每毫升5×104个细胞接种于24孔培养板中，37℃，5%CO2培养箱孵育。实验组分2组，用T8712与RPMI1640培养基按1∶100和1∶200(v/v)分别混合后的培养基培养，对照组用RPMI1640培养基培养。于接种细胞后第1、3、5、7d分别取每组细胞各3孔，分别计数，取其均值，绘制生长曲线；并分别涂片，作Wright染色，每张涂片计数200个细胞，依形态学改变计算其中单核/巨噬样细胞或凋亡细胞数，取3孔的均数、即代表此时的分化率或凋亡发生率。
2.2 NBT还原试验［3］取培养24h后的细胞，PBS洗3次，调细胞浓度为106/ml，取细胞悬液0.1ml加入0.1ml 0.1%NBT-100mg/LTPA-PBS反应液，37℃温育15～30min，PBS洗，涂片，光镜下观察，阳性结果为胞浆内有蓝紫色沉淀，每张涂片计数200个细胞，取均值，即为此时阳性细胞的百分率。
2.3 酸性非特异性酯酶(ANAE)活性检测［4］：取培养24h后的各孔细胞，涂片，于冰冷的10%福尔马林液中固定10min，水洗，置酶孵育液(10mg α-醋酸萘酯溶于20ml 1/15mol/L磷酸缓冲液)中，37℃，1.5h，水洗，镜下见阳性细胞胞浆中有棕红色沉淀。每张涂片计数200个细胞，取均值，即为此时阳性细胞的百分率。
2.4 凋亡细胞DNA琼脂糖凝胶电泳［5］：取培养细胞，PBS洗3次，加入0.5～1ml细胞裂解液(1g/L蛋白酶K，10mmol/L Tris-HCl, 150mmol/L NaCl, 10mmol/L EDTA, 0.4%SDS) 37℃ 24h, 加入等体积酚/氯仿各抽提2次，取上清加入1/10体积3mol/L醋酸钠和2.5体积的无水乙醇，混匀，10 000 r/min离心沉淀DNA，70%乙醇洗，溶入TE缓冲液100μl，加入RNA酶，37℃，30min，而后加入半量的上样缓冲液。制备1.5%琼脂糖凝胶(内含0.5mg/L溴化乙锭)。每孔30μl点样，电压2V/cm，6h，紫外灯下观察并摄片记录。
2.5 流式细胞仪对凋亡细胞数的分析［6］：分别取培养细胞，PBS洗3次，70%冷乙醇固定，染色前PBS洗，后加入50mg/L碘化丙啶，4℃，避光30min，上机测定(流式细胞仪，美国FACS-420型)，所得数据经Sigle Histogram Statistics软件处理，计算出凋亡细胞百分比。
2.6 Bcl-2蛋白的免疫荧光流式细胞仪测定［7］：分别取培养细胞、PBS洗，70%冷乙醇固定，计数各取1×106单细胞悬液，PBS洗，离心，弃上清，加入1∶100稀释的Bcl-2多抗，37℃，水浴30min，PBS洗2次，加入1∶20稀释的羊抗鼠FITC-IgG(中国军事医学科学院微生物研究所)100μl，37℃，温育30min，PBS洗以去除未结合的多余荧光抗体，检测前加入1.0ml PBS液经400目筛网过滤后上机(流式细胞仪，美国FACS-420型，输出功率300mW，激发波长488nm)，测量数据用Sigle Histogram Statistics软件处理。
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