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实验性隐睾诱导小鼠生精细胞凋亡的研究 |
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始将这种主动退化与细胞凋亡联系在一起，很多实验也表明凋亡可能是生殖细胞主动退化的一种机制［1，2］。由于下丘脑-垂体-性腺轴对生殖的明显控制作用，大多数实验集中于有关内分泌对生殖细胞凋亡调节方面的研究，而睾丸还必须在低于体温4～5℃的阴囊中才能正常发育，温度也是重要的调节因素之一。因此，我们以单侧手术隐睾改变精子发生所需要的正常温度的方法来建立生殖细胞凋亡的模型。
许多研究表明bcl-2基因家族是调节细胞凋亡的一个重要基因家族，但家族成员对凋亡的作用却有明显不同。一类促进细胞凋亡如bax、bcl-xs等，另一类则抑制凋亡如bcl-2、bcl-x等［3］。bcl-2基因家族对肿瘤细胞、淋巴细胞凋亡作用的研究很多，对生殖细胞凋亡的作用，最近也有个别报道［4］。我们则研究了Bcl-2、Bax蛋白在正常小鼠睾丸曲细精管中的定位及分布，及其在生精细胞凋亡时，表达的改变。
材料和方法
1.动物来源及动物模型的建立
中国医学科学院动物所提供的8～10周(26～30g)健康雄性昆明小鼠。戊巴比妥腹腔注射麻醉(30mg/kg)，缝合单侧腹股沟管，使小鼠睾丸不能从腹腔下降至阴囊，未手术侧及正常小鼠的睾丸作对照，术后3、6、8、10、12、15d取材，每组动物6～8只。
2.试剂
细胞凋亡试剂盒(Clontech公司)，兔抗小鼠Bcl-2、Bax多抗(Santa Cruz Biotechnology公司，购于北京中山生物技术有限公司)，生物素化的山羊抗兔IgG，荧光素-抗生物素蛋白DCS、山羊血清(Vector Laboratories, Burlingame),ppd(phenylenediamine)、agarose、RNase A、protein kinase (Sigma公司)。
3.睾丸称重及HE染色
小鼠颈椎脱臼法处死，取双侧睾丸，称重。10%中性福尔马林固定24h，常规包埋、切片、HE染色。
4.组织DNA提取及琼脂糖凝胶电泳
从处死的小鼠中取出睾丸(可-70℃保存)，去白膜，研碎，加入10倍体积的buffer(10mmol/L Tris-HCl, pH8.0; 0.1mol/L EDTA,pH8.0;0.5%SDS; 100mmol/L NaCl,4℃过夜)，加RNase A至终浓度40mg/L,37℃，1h；加protein kinase至终浓度100mg/L,50℃，3h;10 000g离心30min，上清用酚/氯仿抽提2次，无水乙醇-20℃过夜，12 000g离心30min。真空抽干，TE buffer (10mmol/L Tris HCl pH8.0; 1mmol/L EDTA, pH8.0)溶解。1.5%琼脂糖凝胶电泳。
5.凋亡细胞的检测及定量数据处理
按照试剂盒说明，以TUNEL法检测凋亡细胞，显绿色荧光的细胞为阳性细胞。按Yin［5］法作数据处理：显微镜下任选5～10个视野，计数50个曲细精管横切面，含凋亡细胞者为阳性曲细精管，再计数15～20个阳性曲细精管中的总细胞数和阳性细胞数，计算凋亡细胞的百分比。每个时间点计算3只小鼠的睾丸，每个睾丸数3张切片。
6.生物素-抗生物素蛋白DCS间接免疫荧光染色
取新鲜睾丸组织，OCT包埋，液氮中冷冻，恒冷箱切片，厚10μm，0.1mol/L PBS配制的10%山羊血清4℃孵育20min，滤纸吸去多余血清，加上用10%山羊血清稀释的(1∶100)兔抗小鼠Bcl-2、Bax多抗，4℃过夜，阴性对照省去此步骤，冷PBS 4℃洗3次，每次5min，加上10%山羊血清稀释的(1∶200)生物素化山羊抗兔IgG，4℃孵育1h，冷PBS于4℃洗3次，每次5min。以荧光素-抗生物素蛋白DCS (1∶200碳酸氢钠缓冲液稀释)4℃孵育1h，冷PBS 4℃洗4次，每次5min，用含10%PBS和1% ppd的甘油封片［6］。标本在Olympus反射式荧光显微镜下观察，并用400 ASA Kodak胶卷摄片。
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