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FAS配体 FASL 在COS |
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展和控制中的作用,本文报道了重组FAS配体在真核细胞中表达的研究。
1 材料与方法
1.1 质粒 pBX-hFASL,含hFASL cDNA,由日本东京大学惠赠；PSVL,真核细胞瞬时高效表达载体,本室保存。
1.2 试剂和试剂盒 WizardTM Maxipreps DNA Purification System,用于提取转染细胞用的质粒DNA,购自Promega公司;所用限制性内切酶购自国内外各公司。
1.3 FASL表达载体的构建 用XbaI内切酶将hFASL cDNA从pBX-hFASL质粒上切出,与经同样酶切并经碱性磷酸酶(CIP)脱磷酸处理的PSVL连接,形成的重组质粒PSVL-hFASL即为FASL的真核细胞表达载体。
1.4 PSVL-hFASL转染COS-7细胞 用胰酶或0.025%的EDTA消化贴壁生长的COS-7细胞,取2×107细胞悬浮于0.5 ml PBS(pH7.2)缓冲液中,加入20 μg质粒DNA,用电击仪(GIBCO BRL)进行电击转染。
1.5 Northern-blot检测FASLmRNA的表达 转染后48 h用异硫氰酸胍一步法提取COS-7细胞的总RNA,取15 μg总RNA进行甲醛变性电泳,毛细法转移到硝酸纤维素膜上,与32P标记的FASL探针进行杂交,放射自显影。PSVL空载体转染的细胞作为对照。
1.6 重组FASL的活性检测 转染后48 h,吸去培养液,用新鲜培养液洗去死细胞,加入FAS＋的U937细胞作为靶细胞(靶效比为1∶1),37℃作用不同时间,按文献［9］提取悬浮细胞(即靶细胞)的DNA,1%琼脂糖凝胶电泳检测细胞凋亡过程中染色体断裂形成的阶梯状带型,用此种方法分析COS-7表达的FASL的活性。
2 结 果
2.1 FASL真核细胞表达载体的构建 将FASL的cDNA插入PSVL的SV40晚期启动子下游,构成表达载体PSVL-hFASL,用BglII和EcoRV对重组质粒进行酶切鉴定,图1为鉴定结果,切出5.02和0.84 kb两个片段为正向插入,切出1.61和4.26 kb两个片段为反向插入。
图1 重组质粒的酶切鉴定
Fig.1 Identification of recombinant plasmids by restriction enzyme digestion
Note:1～6.PSVL-hFASL+BglII/EcoRV(1,2,6.Right direction，3,4,5.Reverse direction);7.DNA molecule weight marker
2.2 COS-7细胞的转染及Northern-blot检测 Northern杂交显示从PSVL-hFASL转染的COS-7细胞提取的总RNA与hFASL cDNA探针杂交呈阳性,而PSVL空载体转染的细胞呈阴性(图2),说明转染后COS-7细胞在mRNA转录水平上获得了FASL的表达,可进行功能及活性研究。
图2 Northern-blot检测hFASL mRNA的表达
Fig.2 Detection of hFASL mRNA by Northern-blot
Note:1.Whole RNA from COS-7 cells transfected with PSVL-hFASL；2.Whole RNA from PSVL mock transfected COS-7 cells as negative control
2.3 重组FASL诱导靶细胞U937产生程序性细胞死亡 COS-7细胞经hFASL表达载体转染,培养48 h后,加入U937细胞作为靶细胞,作用1～5 h,取悬浮的U937细胞进行Giemsa染色观察细胞形态,同时提取U937靶细胞的DNA,进行电泳检测,结果显示:作用4 h后,光镜下可见有些细胞核深染、固缩,有些细胞核呈碎裂状,出现很多泡状颗粒,可能为凋亡小体;作用1 h,电泳显示U937细胞的DNA开始出现阶梯状带型,3 h时梯状条带最为明显,作用5 h后梯状条带消失,染色体DNA断裂形成的片段大小为180～200 bp的倍数,为具有凋亡特征性的阶梯状带型(图3)。
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