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逆转录病毒介导重组CD23 cDNA 稳定整合的RVc23 |
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位和表达调控这一难题，我们设计了用逆转录病毒载体(LXSN neor)介导重组的 CD23 cDNA 进入高表达CD23分子的RPMI8866［4］细胞，建立了RVc23-8866 细胞株，以此作为研究上述问题的生物模型。
1 材料与方法
1.1 试剂 FITC标记的CD23单克隆抗体(ImmunoTech, France)，EcoRⅠ酶、T4连接酶、小肠碱性磷酸酶(均为Promega公司产品)，Lipofectin(GIBCO公司产品)，逆转录病毒载体LXSN (Dr. Miller 惠赠)［5］，CD23cDNA由PGEM-CD23扩增获得。
1.2 细胞株 RPMI8866细胞株，PA317包装细胞(陈慰峰教授惠赠)，NIH3T3细胞均用含15％小牛血清的DMEM培养基在37℃二氧化碳孵箱中培养。
1.3 重组病毒载体的构建 由PGEM-CD23经扩增后，用EcoRⅠ酶切消化分离获得1.6 kb的CD23片段。病毒载体LXSN (5.8 kb，neor)用EcoRⅠ酶切消化，经用小肠碱性磷酸酶作CIP处理后，用T4连接酶在16℃将线性LXSN与CD23 cDNA连接过夜。经转化DH-1和酶切鉴定筛选后，获得纯化的重组复合体PLXCD。
1.4 病毒上清制备 用Lipofectin将重组的病毒复合体转染PA317包装细胞。用含600 μg/ml G418的DMEM筛选2 w，获得抗性细胞克隆。扩增培养，收取病毒上清［5］。
1.5 病毒上清效价测定 取适当稀释的1 ml病毒上清悬浮1×105NIH3T3细胞，加入8 μg的polybrene于37℃、5％CO2环境培养24 h。去除上清，加入5 ml 含1 mg/ml G418 新鲜的DMEM继续培养72 h。去除上清,用台盼蓝染色，计数活细胞克隆数(CFU/ml)［5］。
1.6 病毒上清感染RPMI8866细胞 取1 ml 病毒上清悬浮5×105 RPMI8866细胞。加入终浓度为8 μg/ml的Polybrene，于37℃、5％CO2培养3 h。然后，加入5 ml新鲜的DMEM继续培养48 h。弃上清，用新鲜的DMEM洗2次，然后用含400 μg/ml G418的DMEM筛选14 d，获得抗性细胞［6］，扩增备用。
1.7 RVc23-8866细胞膜上CD23分子检测 用Hank s液洗1×106 RPMI8866细胞2次。用20 μl FITC标记的抗CD23单抗重悬细胞，4℃水浴反应30 min。用Hank s液洗2次［2］，FACS分析结果。
1.8 细胞原位杂交(FISH实验 ) 用地高辛标记的LXSN 探针、CD23探针与用乙酸:甲醇(1∶3)固定的RVc23-8866细胞杂交过夜， FITC 标记的抗地高辛抗体37℃反应30 min，荧光显微镜下观察结果［7］。
2 结 果
2.1 RVc23-8866 细胞与RPMI8866 细胞的比较 经G418连续3次(14 d/每次),RVc23-8866细胞均能在含G418 的DMEM中生长，而RPMI8866细胞则全部死亡 (材料未列出)。FACS 和FISH分析证实 RVc23-8866细胞的膜蛋白分子表达，染色体基因组和细胞形态均已改变。
2.1.1 RVc23-8866 细胞与RPMI8866细胞形态的比较 在倒置显微镜(10×40 倍)下观察可见，RVc23-8866 细胞增大,且细胞内空泡增多。提示逆转录病毒介导外源基因插入RPMI8866细胞，影响了细胞的生长代谢(见图1)。
图1 经G418筛选的RVc23-8866细胞与RPMI8866细胞的比较
Fig.1 Comparing RPMI8866 cells with RVc23-8866 cells by G418 screening
2.1.2 FACS 分析RVc23-8866细胞膜CD23分子的表达 FITC 标记的CD23 单抗检测，FACS分析证实：RVc23-8866细胞膜荧光强度比正常RPMI8866细胞显著降低，提示RVc23-8866细胞膜CD23分子的表达量降低，外源基因影响了细胞CD23膜蛋白分子的表达(见图2：横坐标表示荧光强度，纵坐标表示细胞数)。
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