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抗人纤维蛋白单链抗体 |
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纤维蛋白单链抗体分子与链亲和素融合蛋白表达载体，表达产物具有结合人纤维蛋白和生物素的双种功能。为了探索这个产物的应用前景，我们对其稳定性及与不同动物纤维蛋白的结合进行了研究。
1 材料与方法
1.1 表达载体 我室成功地克隆了鼠源抗人纤维蛋白单链抗体重链和轻链可变区基因，表达的抗人纤维蛋白单链抗体(scFv-8E5)具有特异性结合人纤维蛋白的活性［4］。随后构建了scFv-8E5基因与链亲和素基因的重组表达载体pSTE2-8E5（图1）。链亲和素基因位于scFv-8E5基因的3′端,构成嵌合基因。在嵌合基因的5′端有果胶酶先导序列，受控于上游的Lac启动子, 在IPTG的诱导下启动表达。嵌合基因3′末端的C-myc短肽密码子可作为表达产物的标记，6个组氨酸密码子用于表达产物的纯化。
图1 重组的表达载体pSTE2-8E5
Fig.1 Restriction map of recombinant expression vector pSTE2-8E5
1.2 scFv-8E5:core-streptavidin的表达和纯化 选取经酶切鉴定正确的阳性克隆用LBGA(含有50 μg/ml氨苄青霉素、100 mmol/L葡萄糖的LB)培养过夜，次日1∶40倒入新鲜LBGA，待OD600为0.8时加入100 μmol/L IPTG诱导，室温振摇3 h后收集菌体，超声裂解细胞收集包涵体,用含3 mol/L尿素、50 mmol/L Tris-HCl、pH 7.0的溶液洗涤后加入6 mol/L盐酸胍、0.1 mol/L Tris-HCl、pH 7.0溶液溶解，经IMAC柱一步纯化［5］。用TEA缓冲液（0.4 ml精氨酸-HCl，0.1 mol/L Tris-HCl,2 mmol/L EDTA,pH 7.0）透析复性后分装保存备用。
1.3 SDS-PAGE电泳 100 μmol/L IPTG诱导组菌体总蛋白及经IMAC柱纯化的包涵体蛋白用10% 聚丙烯酰胺还原电泳,考马斯亮蓝染色后观察。
1.4 scFv-8E5:core-streptavidin 融合蛋白的活性分析 用改进的酶联免疫吸附实验(ELISA)观察 IMAC 柱纯化的scFv-8E5: core-streptavidin对各种纤维蛋白的识别［4］。用各种纤维蛋白原分别包被96孔板，37 ℃烤干，用含15%牛血清的DMEM培养液活化纤维蛋白原为纤维蛋白，加入相同剂量纯化的scFv-8E5:core-streptavidin，再加入1∶150生物素标记的辣根过氧化物酶(购自华美)， 用四甲基联苯胺（TMB）为底物。2 mol/L H2SO4终止反应后用酶标仪检测450 nm处的光吸收值。待测 OD值/阴性对照≥2.1判为阳性，＜2.1判为阴性。ELISA中所用融合蛋白浓度为37.7 μg/ml（为与40 μg/ml人纤维蛋白结合的平台剂量）。
2 结 果
2.1 scFv-8E5:core-streptavidin的表达 100 μmol/L IPTG诱导表达的产物经SDS-PAGE电泳表明， scFv-8E5: core-streptavidin融合蛋白单体的分子量约45 kD左右。经IMAC柱纯化后融合蛋白成为主带，纯度高，见图2。
图2 总蛋白和包涵体的SDS-PAGE电泳
Fig.2 SDS-PAGE of total cell extracts and inclusion bodies
Note:M. Protein molecular weight markers; Lane 1. E. coli JM109 transfected with pSTE2-8E5 induced with 100 μmol/L IPTG; Lane 2. E. coli JM109 transfected with pSTE2-8E5 without IPTG; Lane 3. Protein from inclusion bodies purified by IMAC
2.2 scFv-8E5:core-streptavidin的稳定性 ELISA检测IMAC柱纯化后的融合蛋白与人纤维蛋白的结合，以0℃保存的融合蛋白为阳性对照，阴性对照用PBS代替融合蛋白。融合蛋白冻融1～3次、4℃保存1～2 w上一页 [1] [2] [3] 下一页
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