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HIV |
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y for the production of HIV-1 diagnose reagents.
Key words Novel vector HIV-1 Capsid protein Purification
人I型免疫缺陷病毒(HIV-1)是导致人获得性免疫缺陷综合征的主要病原。目前对HIV-1感染的诊断，临床上的方法主要是通过检测患者血清或血浆中的特异性抗体水平，所检测的指标包括HIV-1 env基因的编码产物，包括外膜蛋白gp120，跨膜蛋白gp41和gag基因的编码产物，包括核心蛋白p24和基质蛋白p17等［1］。 病毒的核心蛋白(Capsid protein,CA)p24形成病毒粒子的疏水性衣壳，为构成病毒核心结构的主要蛋白。由于p24在病毒粒子中含量丰富(一般约占1 200个拷贝) ［2］，其序列在不同的毒株间相对保守，并且其引发的p24抗体水平可作为判断HIV感染和AIDS病情发展的间接指标，因此，p24在AIDS的研究与HIV-1感染诊断中占有重要地位。本研究通过自建通用型高效原核表达载体，在大肠杆菌中表达了重组p24，并对其进行了初步纯化、鉴定，对于AIDS的诊断，预防工作具有十分重要的意义。
1 材料与方法
1.1 菌株与质粒 质粒pET17-24由本室构建，含HIV-1 gag基因nt680-nt1857。质粒pBV220由中国预防医学科学院病毒所惠赠［3］。质粒pET28b，大肠杆菌BL21(DE3)plyss,HMS174(DE3)购自Novagen公司，大肠杆菌HB101，DH5α为本室保存菌株。
1.2 所用试剂与工具酶 Ni-NTA Agarose为德国QIAGEN公司产品，IpTG、尿素、NBT、BCIP为德国Boehringer Mannheim公司产品，p24单克隆抗体为本室制备,HIV-1标准阳性血清由中国预防医学科学院病毒所邵一鸣教授惠赠。
1.3 表达质粒的构建 有关的DNA操作参见《分子克隆》［4］。
1.4 工程菌的培养及诱导 重组质粒pBG-1b分别转化E.coli BL21、BL21(DE3)、 BL21(DE3)plyss、HMS174(DE3)，于LB培养基中，于37℃振荡培养至OD600为0.8时，加入IPTG至终浓度1 mmol/L，诱导3～4 h 后收菌；重组质粒pBG-7b转化E.coli DH5α，于LB液培养基中于30℃振摇培养至OD600为0.45～0.60时，42℃诱导培养5～6 h，离心收菌，上SDS-PAGE,分析表达量。
1.5 SDS-PAGE和Western-blot 操作方法参见文献［5］。
1.6 重组蛋白的纯化
1.6.1 菌体的裂解与重组蛋白的存在形式分析［6］ 将温控诱导后的菌体按1/100培养基体积重悬于buffer A(50 mmol/L NaH2P4，pH 8.0；300 mmol/L NaCl；10 mmol/L imidazole)中，加入溶菌酶至终浓度1 mg/ml，超声破碎后，离心，分别收集上清和沉淀，进行SDS-PAGE，用考马斯亮蓝R-250 染色，分析重组蛋白的存在形式。
1.6.2 上清中重组蛋白的纯化 将温控诱导后的菌体(含重组质粒pVG7b的受体菌DH5a)按1/100培养基体积重悬于buffer A中，超声破碎，离心，分离包涵体和上清，包涵体经buffer B(10 mmol/L Tris.Cl 100 mmol/L NaH2PO4,8 mol/L Orea,pH 8.0)中变性后，将混合物注入平衡好的微型层析柱，用不同PH值的buffer进行洗脱，上清中的重组蛋白用含有不同咪唑浓度的buffer进行洗脱，分步收集各洗脱液，取样后上SDS-PAGE观察重组蛋白纯度。
1.7 间接ELISA 将纯化的表达产物包被ELISA板，与不同HIV-1阳性血清进行间接ELISA反应。
2 结 果
2.1 温控型表达载体pVV5b的构建 对质粒pET28a/b、c，和质粒pBV220分别用 sty I酶、EcoRI酶进行酶切，经补平，连接后，构建了重组质粒pBE-4a/b、c，后者经 Sal I酶切除多余片段后，自身环化，构建了重组质粒pVV5a/b、c。从质粒pEG1b中，再调出p24 gag基因，定向克隆到质粒pVV5b中，构建了重组质粒pEG7b。
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