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超抗原诱导T细胞凋亡或增殖的体外研究 |
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蛋白酶K、RNase A、DNA Marker(λDNA/EcoRⅠ+HindⅢ)(华美)。
1.1.2 白细胞成分血液标本 重庆西南医院输血科，批号971124-1538。
1.1.3 细胞培养液 10% NCS的RPMI 1640培养液，其中含100 U/ml青霉素，100 μg/ml链霉素，10 mmol/L HEPES，2 mmol/L L-Gln。
1.2 方法
1.2.1 短期人外周血SEA反应T细胞系的建立 参照文献［4］，略有修改。按常规方法分离人外周血单个核细胞(PBMC)。PBMC 106 cell/ml，加入SEA 0.5～5.0 μg/ml，37℃，5% CO2的饱和湿度条件下培养3 d，第4天换液，Hank′s溶液离心，洗涤2次，尽可能去除SEA。单核巨噬细胞因粘附在瓶壁，在换瓶培养中可去除。培养液中加入200 U/ml的rIL-2，经过14 d含rIL-2的RPMI 1640完全培养液培养，短时SEA反应T细胞系即可建立。
1.2.2 SEA诱导短期人外周血SEA反应T细胞系凋亡 收集短期人外周血SEA反应T细胞，Hank′s溶液洗涤离心100 g×10 min，细胞用含10%NCS的RPMI 1640完全培养液悬浮，调整密度为5×105 cell/ml，加入24孔平底细胞培养板(Costar)，1 ml/孔，37℃，5% CO2的饱和湿度条件下培养2 h。细胞培养液中加入SEA 1 μg/ml，继续培养。
1.2.3 SEA诱导短期人外周血SEA反应T细胞增殖 同上收集细胞洗涤及培养，只是加入的24孔平底细胞培养板上已有贴壁生长的单核巨噬细胞(102～103细胞，此细胞的获得同1.2.1)，观察细胞生长情况及检测。
1.2.4 短期人外周血SEA反应T细胞凋亡检测 于培养的不同时间(0、2、4、8、16、24、32 h)收集细胞检测。用PI低渗荧光染色液染色(PI 50 μg/ml，枸椽酸钠0.1%，Triton X-100 0.1%)，参照文献［5］，FCM检测亚G0/G1峰大小(A0)，反映已固缩和降解核DNA的细胞数，即凋亡细胞比率。试验2次，取平均值。常规方法提取细胞DNA［6］，1.8%琼脂糖凝胶电泳观察凋亡细胞DNA梯状电泳带。
2 结 果
2.1 短期人外周血SEA反应T细胞系的特点 经SEA刺激，rIL-2作用后，PBMC的T淋巴细胞于第4天开始大量增殖，细胞数量明显增多，形成大量聚集在一起的细胞集落，细胞增大，拉长，母细胞化现象明显。SEA刺激后，从第7天开始，细胞出现死亡，数量逐渐增多，死亡细胞主要是B细胞和SEA非特异性T细胞，这与只用rIL-2维持生长而未用SEA刺激的对照PBMC培养中表现相似。至第14 天死亡细胞开始减少，细胞生长与死亡达到平衡状态。SEA反应T细胞系可在体外连续培养40 d左右，在此过程中必须维持IL-2的作用，否则细胞增殖后很快死亡［7］(图1A)。
图1 SEA诱导SEA反应T细胞凋亡的形态(200×)
Fig.1 Morphology of apoptosis induced by SEA in SEA-specific T cells(200×)
Note: A. The SEA-specific T-cell lines，B. 8 h treated again by SEA 1 μg/ml
2.2 SEA诱导人外周血短期SEA反应T细胞凋亡 SEA 1 μg/ml诱导同样剂量刺激建立的短期SEA反应T细胞凋亡非常明显。光镜下，作用8 h可观察到部分细胞死亡，作用16 h则出现比较明显的凋亡细胞特征(图1B)。FCM分析亚G0/G1峰(A0)显示，随着诱导时间的延长，凋亡量逐步升高，至作用的第16 h，细胞凋亡量可达58%。SEA反应T细胞(SEA 1 μg/ml使用剂量诱导建立)凋亡量随SEA再次刺激浓度(0.5～6.0 μg/ml)的升高而增加(图2)。1.8%DNA琼脂糖凝胶电泳显示作用16 h呈明显的梯状条带(图3)。
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