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抗重组人血管生长素单克隆抗体的制备及鉴定 |
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按常规方法［2］用纯化的rhANG免疫6周龄Balb/c小鼠，共3次，每次间隔3 w，200 μg/(次.只)。融合前3天腹腔注射rhANG 300 μg/只，取小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞在50％PEG作用下融合，融合细胞置HAT选择培养液37℃，CO2培养箱培养。1 w后待细胞长至1/3孔时，用间接ELISA对杂交瘤细胞培养上清进行筛选。将阳性孔杂交瘤细胞以有限稀释法进行亚克隆，当克隆孔的阳性率达100％时再扩大培养，冻存，制备腹水。
1.3 ELISA测定 按常规方法［3］进行rhANG抗原的包被，浓度为1 μg/ml，其它细胞因子亦以相同浓度包被，以诱导前PBV220／ANG／JM103菌体裂解液蛋白做无关对照抗原。
1.4 双向扩散法测Ig亚类 杂交瘤培养上清装入透析袋置40％，分子量8 000的PEG中浓缩至6倍，与抗鼠亚类血清作双扩实验。
1.5 免疫转印 纯化的ANG，PBV220／ANG／JM103诱导前和诱导后菌体裂解液经SDS-PAGE分离［4］。按常规方法在Bio-Rad电转移系统中将凝胶蛋白带转移至硝酸纤维膜上，依次用10％小牛血清封闭，杂交上清为一抗，羊抗鼠标记辣根过氧化物酶IgG为二抗，以DAB系统显色。
2 结 果
2.1 细胞融合及筛选 免疫小鼠脾细胞与SP2／0融合后，分别培养在96孔板和24孔板各2块，1 w后60％孔有杂交瘤细胞生长，用ELISA筛选，ANG阳性3孔，经3次亚克隆有2株能稳定地分泌抗体，分别命名为C46、C6，另1株C1分泌不稳定。
2.2 抗体类别及亚型 C6和C46杂交瘤细胞株分泌抗体的免疫球蛋白类型分别为IgG1、IgM。
2.3 单抗的特异性鉴定 两株抗人ANG单抗与多种人细胞因子，人及动物血清和诱导前宿主菌蛋白无反应，而只与纯化的ANG和诱导后的菌体裂解液蛋白反应。结果见表1、表2。
表1 抗人ANG单克隆抗体的特异性反应
Tab.1 Specific reaction of anti-human ANG monoclonal antibodies
GM-CSF TNFα IFN IL-2 ANG
C46 - - - - +
C6 - - - - +
表2 抗人ANG单克隆抗体与不同血清及菌体的反应
Tab.2 The reaction of anti-human ANG monoclonal antibodies with different serums and thalluses
Serum Thallus proteins
Human Bovine Rabbit Before inducement After inducement
C46 - - - - +
C6 - - - - +
2.4 SDS-PAGE 电泳及免疫转印结果 纯化重组人ANG，SDS-PAGE结果显示其分子量为14.4 kD，诱导后菌体蛋白与纯化的ANG相应位置出现沉淀线，见图1A。免疫转印结果显示，2个抗体识别14.4 kD的rhANG而不和诱导前的菌体裂解液蛋白反应，见图1B。
图1 SDS-PAGE电泳图谱和SDS-PAGE免疫转印
Fig.1 The result of SDS-PAGE and SDS-PAGE immuno-blotting
Note:1.standard proteins,2.purification,3.thallus proteins before inducement,4.thallus proteins after inducement
3 讨 论
目前国外对ANG进行了大量研究，其基因定位、理化性质、生物活性和作用机理比较清楚［5］。但国内ANG单克隆抗体的研究未见报道。本实验制备ANG拮抗剂-单克隆抗体，旨在研究ANG单克隆抗体在ANG依赖型恶性肿瘤的治疗作用。综合上述实验结果，作者认为本实验所制备的二株抗ANG单抗均有较强的特异性，与多种基因工程产生的细胞因子无交叉反应，不与正常人血清、兔血清及小牛血清反应，双扩及免疫转印实验证实抗体不与诱导前PBV220／ANG／JM103菌体蛋白反应，仅识别14.4 kD的ANG。此单抗的制备上一页 [1] [2] [3] 下一页
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