|
HLA |
| |
7*06。以上类生长激素(HGH)基因特异性引物为内对照：5′-GCC、TTC、CCA、ACC、ATT、CCC、TTA，5′-TCA、CGG、ATT、TCT、GTT、GTG、TTT，扩增产物为429 bp。以上引物由美国G&T公司合成、纯化及鉴定。
1.3.3 PCR 将B27引物、内对照引物、MgCl2、Tris、明胶、KCl、dNTP及溴酚蓝等按一定比例(配方将另文报道)配制为PCR反应混合物(B27 Mix)，取B27 Mix 8 μl、被检DNA 100 ng、Taq DNA聚合酶0.5单位混合放入PCR机扩增，循环参数为95℃ 5 min预变性，然后95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 90 s，共30个循环。
1.3.4 PCR产物检测 以1.5%琼脂糖凝胶(含0.5 μg/ml溴乙锭)，0.5×TBE缓冲液，5 V/cm电压电泳30 min，100 bp ladder为参照物，302 nm波长紫外透射仪下分析结果。
2 结 果
2.1 具有HLA-B27基因的样本经PCR扩增出现144 bp特异性区带及429 bp内对照带，无B27基因者只出现429 bp内对照带。如果Taq DNA聚合酶质量欠佳，则有时出现一条大于429 bp的额外区带，并不影响B27基因的判定。上述结果经G&T公司提供的3份具有B27基因DNA及4份无B27基因DNA重复验证，如图1所示。
图1 HLA-B27基因检定
Fig.1 HLA-B27 genotyping
Note:M.100 bp ladder;lane 1,2,3.without B27 gene;lane 4,5,6.with B27 gene;lane 6,7 as a same sample;lane 7 used low quality Taq DNA polymerase
2.2 本组78例可疑AS者中，具有B27基因者36例，其中34例符合AS诊断标准(X线片证实骶髂关节炎，并附加下列临床表现中1条或2条：腰椎运动受限；腰背疼痛及僵硬感；胸廓扩张受限)，2例X线片无异常不能诊断为AS。无B27基因者42例，其中2例符合AS诊断标准。
2.3 HLA-B27基因与表型检查结果比较
2.3.1 36例具有B27基因者中，24例同时作血清学试验检查B27表型，其中1例血清学结果为阴性，4例血清学结果可疑(2例1孔血清阳性，积分6；2例(2孔血清阳性，积分4～8)，其余样本4孔血清均阳性。结果均重复验证。
2.3.2 42例无B27基因者中，21例同时作血清学试验，3例血清学结果可疑(1～3孔阳性，积分4)，其余样本4孔血清均阴性。结果均重复验证。
3 讨 论
既住采用微量淋巴细胞毒试验检查B27表型有如下缺点：要求新鲜血至少2 ml，分离的淋巴细胞要有足够数量及活力才能供试验，特殊情况下取材困难；标本难以长期保存供复核或送其他实验室验证；难以获得相关系数r为1.00或强度SI%为100的B27单价抗血清，单份血清有可能漏检或出现假阳性额外反应，如果同时用几份不同批号的血清试验，结果不一致时很难下结论；不同厂家、不同批号的血清定型板的质量难以统一化、标准化，造成不同实验室的结果不易相互比较。本组样本中血清学试验时仅部分血清阳性和／或积分低而难以判定结果，占16.3%(7/43)，此时常要凭“经验”或对血清质量分析来判定结果，常含主观人为因素，很难避免误定B27表型。本组还发现血清学漏检者1例。
HLA-B27基因的DNA序列已经清楚，WHO认定有8个等位基因。我们采用PCR技术，可以扩增B27全部等位基因［4］，含内对照引物确保结果可靠。本方法的优点是：仅需少量血样，提取的DNA可保存数年以供复核或送其他实验室验证；快速，采用快速法30 min提取DNA，PCR约2 h，电泳30 min，半天之内可出结果，适于临床常规；准确，分析结果客观，根据内对照带及有无特异性区带判定结果一目了然；试剂系合成品，易于统一化和标准化，有利于各实验室互相比较结果。
上一页 [1] [2]
上一个医学论文： 抗人VEGF单抗的研制及对肿瘤生长及转移的抑制作用
下一个医学论文： 抗重组人血管生长素单克隆抗体的制备及鉴定
|
|
|
|
|
|
|
您现在的位置： 绿色健康网 >> 医学论文 >> 基础医学论文 >> 正文