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抗人VEGF单抗的研制及对肿瘤生长及转移的抑制作用 |
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nesis Vascular endothelial growth factor Neutralizing Monoclonal antibody
血管形成即一个微血管床的形成及发展是许多重要生理过程所必需的［1］，其在多种疾病的发生发展中也起着重要的作用［2］。近年来随着血管形成机制的逐渐阐明及各种血管因子的分子克隆，通过阻断血管形成治疗这些疾病的研究引起了广泛的关注。血管形成受多种血管形成因子的调节，如血管内皮细胞生长因子（VEGF）、表皮生长因子、纤维母细胞生长因子、血小板原生长因子和转化生长因子 ［3］ 等，其中VEGF能特异性地促血管内皮细胞分裂增殖，促血管形成，同时增加血管通透性，使血管内成分渗漏，为血管内皮细胞的迁移及血管形成提供基质，在肿瘤的生长和转移中发挥较为重要的作用［4］。因此本文用原核表达的人VEGF为抗原研制抗VEGF单抗，并初步探讨了该单抗在肿瘤生长及转移中的作用。
1 材料与方法
1.1 试剂、动物及细胞 PEG4000，HAT， Protein A Sepharose-Fast Flow胶，均为Sigma产品。 胎牛血清为Hyclone产品。125I同位素为New England公司产品。6～8周龄Balb/c小鼠及IVT2MA-891津白II小鼠自发乳癌肺转移模型均由中国医学科学院肿瘤所动物室提供。豚鼠及九日龄鸡胚购自卫生部生物制品研究所。小鼠骨髓瘤细胞SP2/0-Ag14为本室保存培养。
1.2 杂交瘤的制备 将含有人VEGF165基因的重组原核表达质粒转化E.coli POP-2136菌，诱导表达，分离，纯化，纯度达95%以上。经Miles、CAM和HuVEC实验鉴定具有生物活性。以此蛋白作为抗原免疫Balb/c小鼠。按常规杂交瘤制备法，获得阳性杂交瘤克隆。应用标准抗鼠抗体以免疫双扩散法进行单抗亚类分析。
1.3 腹水的制备及抗体的纯化 按常规方法用Balb/c小鼠制备腹水。属IgG类单抗，用Protein A Sepharose-4B Fast Flow柱纯化；属IgM类单抗，用交联有VEGF165 Sepharose 4B的亲和层析柱（本室自制）纯化。纯化后的单抗经SDS-PAGE胶电泳分析鉴定纯度。
1.4 Western blot分析 复性的VEGF蛋白在15%PAGE胶中分别进行非还原和还原电泳。将电泳分离的样品电转移至Immobilon-p膜上（millipore公司产品），与纯化的VEGF单抗4℃反应2 h，洗涤后与辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG室温反应2 h，底物显色、漂洗。
1.5 放射免疫竞争抑制实验 用Iodogen法125I标记纯化的VEGF单抗，标记率为90%以上。用纯化的VEGF165抗原包被反应管后，加1×106cpm的125I标记的某一VEGF单抗，再加入过量的（标记抗体的100倍）其余未标记的纯化VEGF单抗，每一浓度的未标记抗体设3个平行管。4℃孵育过夜，洗涤后测cpm值，取其均值。
1.6 中和活性测定 HuVEC测定按杨小平法［5］，Miles豚鼠皮肤血管通透性实验［6］加以改进，鸡胚绒毛尿囊膜促血管形成实验（CAM）按参考文献［7］方法进行。
1.7 肿瘤生长及转移动物实验 将IVT2MA-891肿瘤研磨制成单个细胞悬液接种于TA2×165F1小鼠后腿皮下，1×105细胞/只。3 d后随机分组，并给予抗体治疗，每组6只，设抗体治疗组和PBS组。抗体治疗组腹腔注射VEGF单抗D11每只 200 μg/次，每天1次，PBS组每天注射PBS1次，连续20 d。触及肿瘤后，每3天测肿瘤大小。停药5 d后处死动物，称取瘤重并计肺转移结节数。
2 结 果
2.1 重组VEGF165蛋白的表达及生物活性分析 SDS-PAGE胶电泳结果表明pkpl-3b-VEGF165克隆表达分子量为43 kD的同源二聚体VEGF蛋白，目的蛋白表达量占细菌蛋白的30%左右，纯度达95%以上。所表达的VEGF165蛋白使Miles实验呈明显的皮肤蓝斑阳性反应，注射PBS的部位无蓝斑出现，表明注射VEGF抗原可引起局部皮肤血管通透性增加。HuVEC增殖测定和CAM血管形成实验也证实表达的VEGF具有促血管内皮细胞增殖和血管形成的生物活性，以此抗原制备单抗。
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