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多重耐药基因在睫状体上皮细胞容积调节中的作用 |
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MDR)基因在其中所起的作用有许多争论［4，5］。本文应用基因表达反义技术，抑制MDR基因表达，以阐明MDR基因与细胞容积调节的关系。
材料与方法
(一)MDR1反义寡核苷酸：本实验所用两种反义寡核苷酸(antisense oligonucleotide, 简称anti)由15个碱基组成(Severn Biotech Ltd, UK)。一种与人类MDR1基因mRNA起始码区(第416～430碱基)互补(5′ATC CAT CCC GAC CTC 3′)，简称人MDR1-anti。另一种与小鼠MDR1基因mRNA起始码区(第101～115碱基)互补(5′CTC CAT CAC CAC CTC 3′)，简称鼠MDR1-anti。为了测量上述两种反义寡核苷酸的导入量，用荧光标记人MDR1-anti第4，11碱基和鼠MDR1-anti第1，15碱基。
(二)细胞分离和培养：牛眼睫状体上皮细胞按Jacob［6］描述的方法分离和培养。用E199(含10%小牛血清)培养液孵育14～18 h，更换培养液，按不同组别分别处理。
(三)实验分组：分别在各处理组培养液中加入不同成份、不同浓度的药物，再培养24或48 h。测量MDR-anti的导入量和细胞在低渗液刺激下的容积变化。(1)空白对照组；(2)Lip组：阳离子脂质体-lipofectin (Lip) 20 μg/mL;(3)M-A 5组：鼠MDR1-anti 5 μg/mL;(4)M-A 10组：鼠MDR1-anti 10 μg/mL；(5)A-Hypo组：230 mOsm/L低渗液(含鼠MDR1-anti 10 μg/mL)浸浴40 min，更换为E199培养液(含鼠MDR1-anti 10 μg/mL)；(6)M-LA5组：鼠MDR-anti 5 μg/mL;(7)M-LA 10组：鼠MDR-anti 10 μg/mL；(8)M-LA 200组：鼠MDR-anti 200 μg/mL；(9)H-LA 50组：人MDR-anti 50 μg/mL；(10)H-LA 100组：人MDR-anti 100 μg/mL；(11)H-LA 200组：人MDR-anti 200 μg/mL。 6～10各组分别用Lip 20 μg/mL与MDR-anti混合后再处理细胞。
(四)灌流液：等渗灌流液渗透压300 mOsm/L,内含(mmol/L)：105 NaCl,0.5 MgCl2，2 CaCl2，10 HEPES， 70 D～甘露醇，用蔗糖调至300 mOsm/L；低渗灌流液渗透压230 mOsm/L，除不含甘露醇和蔗糖外，其他成分和浓度与等渗液相同。2种灌流液用Tris调至pH7.4。
(五)MDR-anti荧光测量：各组荧光标记细胞如上述分别处理24 h或48 h后，在激光共聚焦显微镜(Noran Instruments, Middleton, WI, USA)下拍摄图像，检测细胞内anti的荧光，获取图像用Metamorph图像分析系统(Universal Imaging Corporation, USA)分析，荧光(灰度)： 0=黑，255=白。
(六)细胞容积测量：用LS50B发光分光计(Perkin-Elmer, UK)连续测量和记录处理48 h后H-L A 200组、M-LA 200组和空白对照组在低渗液中细胞容积变化。当细胞在低渗液中肿胀时，光度下降。而细胞通过RVD使其容积减少，趋向恢复正常时，光度回升，用配套软件对所测光度值进行标准化处理分析。
(七)统计方法：本文数据以均数±标准差(±s)表示，均数差异显著性检验用t检验。图中圆括号内数据是观察例数。
结果
一、MDR-anti的荧光标记图像：
图1分别是空白对照组、M-LA 10组、H-LA 200组处理48 h后普通光学图像(上行a、b、c)和相应激光共聚焦扫描荧光图像(下行d、e、f)。左列是对照组，中列是M-LA 10组，右列是H-LA 200组。从图1可见，在Lip和MDR-anti处理48 h后，细胞内有较强的MDR-anti荧光。
Fig 1 Uptake of fluorescently labelled MDR-antisense
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