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人癌细胞线粒体DNA控制区序列特征分析 |
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rial DNA, mtDNA)的遗传信息显示出自然界中少见的合理性与经济性。在仅仅16 569bp长的基因组内，定位了2种rRNA、 22种tRNA和13种蛋白多肽基因。 除D环(displacement loop)区以外，在相邻的基因之间极少有非编码碱基。 因此，常把D环区第16 024至575位核苷酸之间的 1 120bp片段称为控制区， 它负责整个mtDNA分子复制和转录的调控〔1〕。mtDNA分子游离于线粒体基质中，缺乏组蛋白保护，其损伤修复系统功能也不完善，与核DNA相比， 它更容易受各种致癌物的攻击〔2〕。因此，关于mtDNA损伤与突变在细胞癌变中的地位和作用机制研究已受关注〔3〕 。我们前期的研究表明，癌细胞mtDNA基因编码区序列非常稳定(另文报道)。为了进一步探讨线粒体遗传系统与细胞癌变之间的关系，本文分析了癌细胞mtDNA控制区序列的变化特征。
1 材料与方法
1.1 主要试剂
PCR试剂盒、PCR产物纯化试剂盒、限制性内切酶HaeⅢ(GG↓CC)和EcoRV(GAT↓ATC) 均为德国宝灵曼公司产品。
1.2 人癌细胞系
选用4个肺腺癌细胞系即SPC-A-1 (中国科学院上海细胞生物学研究所)、PLA-801D(解放军301医院)、 A549和A531(美国)，1个肝细胞癌细胞系SMMC-7721(二军大), 1个膀胱上皮癌细胞系EJ(美国)。
1.3 临床资料
随机选择癌患者8例，包括肺腺癌3例，肺鳞癌2例，食道和喉鳞癌各1例, 卵巢腺癌1例，其中男性7例，女性1例，平均年龄52.4岁。健康成人8例，其中男性5例，女性3例， 平均年龄51.1岁。各抽取肝素抗凝静脉血1ml备用。
1.4 引物序列
引物1: 5 -ATTCTAACCTGAATCGGAGG-3 ，引物2: 3 -TCTAATGTGTACGTTCGTAG-5 。它们分别位于mtDNA Cytb和12S rRNA基因区内，扩增包括1 120 bp控制区序列在内的1 528 bp片段。
1.5 mtDNA模板的制备
癌细胞及外周血白细胞mtDNA的制备分别参见文献〔4, 5〕。
1.6 PCR扩增及产物鉴定
PCR扩增总体积为100μl。94℃预变性5分钟, 然后94℃变性1分钟、55℃退火1分钟、72℃延伸2分钟, 35个循环后于72℃延伸7分钟结束。PCR产物的鉴定参见文献〔4, 5〕。
1.7 PCR产物酶切、电泳及图谱分析
每管取15μl PCR反应终产物，加入HaeⅢ或EcoRV(5u), 37℃水浴反应4小时，于2.5%琼脂糖凝胶(含0.5μg/ml溴化乙锭)，6V/cm恒压下电泳2小时, 紫外灯下观察并拍照。参照人mtDNA剑桥序列〔6〕进行酶切图谱分析。
1.8 PCR产物直接测序
SPC-A-1细胞1 528bp片段经纯化后, 测序引物同前，在ABI Prism377型测序仪上，采用双脱氧四色荧光染料标记法全自动测读序列。
2 结果
2.1 mtDNA PCR扩增
6个癌细胞系mtDNA 1 528bp片段均呈阳性；8例癌患者白细胞中，6例阳性，2例阴性；8例健康成人白细胞中，4例阳性，4例阴性。
2.2 1 528bp片段HaeⅢ酶切
癌细胞组：A549、PLA-801D、EJ 3个癌细胞系，出现了138bp、573bp、435bp、382bp(5 →3 )共4个片段，其酶切位点与人mtDNA剑桥序列相应区段HaeⅢ酶切位点完全一致； 而SPC-A-1、SMMC-7721、A531 3个癌细胞系，其573bp和138bp两个片段消失，出现了711bp的新片段，且435bp片段均消失，凝胶上未能显示出其新的核酸片段。癌患者白细胞组：在1 528bp片段阳性的6例中，有4例的酶切格局与人mtDNA剑桥序列相应区段HaeⅢ酶切格局相一致，其余2例肺癌的435bp片段消失，凝胶上未能显示出其新的核酸片段。健康成人白细胞组：4例阳性个体中，1 528bp片段经HaeⅢ酶切格局与人mtDNA剑桥序列相应区段HaeⅢ酶切格局完全一致(图1)。
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