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肝豆状核变性类似杂合丢失现象的报告及可能机制探讨 |
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环阳性以及血清铜蓝蛋白和血清铜水平低下，24h尿铜含量增高，同时患者父母兄弟姐妹甚至其祖父母、外祖父母等均全面采集。正常对照在神经内科门诊采集共10例。
1.2 DNA标本的提取
抗凝外周静脉血10ml，经酚、氯仿、异戊醇、蛋白酶K等方法提取，无水酒精抽提，TE溶解DNA, 置-40℃保存。
1.3 PCR反应扩增
引物由本室合成，该异常表现的外显子为exon 8, 引物序列与Thomas等报道一致。
exon 8 引物序列：Primer 1: AACCCTTCACTGTCCTTGT;Primer 2: AGGCAGCTCTTTTCTGAAC。
扩增条件：95℃ 2min, 94℃ 40s, 53℃ 50s, 72℃ 30s（35 个循环）, 72℃ 10min, 30 μl体积。
1.4 SSCP分析
PCR扩增产物为296bp，故采用8%的非变性丙稀酰胺胶，其中加入5%的甘油，缓冲液为0.5×TBE。PCR产物15μl加入5μl去离子甲酰胺、溴酚蓝和二甲苯晴混合剂，97℃ 10min变性，立即置冰浴中10min加样。电泳条件：25℃ 200V, 36～48h。电泳结束后银染。
1.5 序列分析
对SSCP异常者进行序列分析，将PCR产物作为模板（双链DNA）, 经蛋白酶K处理，酚、氯仿抽提，过Sepharose 8L柱，以去除蛋白质、杂质、多余的引物和dNTP。序列分析链终止反应采用Promega公司的fmol DNA测序盒，以及α-32P ATP（北京亚辉生物工程公司）进行标记，反应完毕94℃变性5min，含7mol/L 尿素的变性聚丙稀酰胺凝胶电泳。电泳条件：室温下 1 800 V 3h，放射自显影。为了清楚显示DNA片段的每一个碱基，序列分析重复从两个方向进行。
1.6 亲子鉴定
PCR扩增4个微卫星DNA标记vWF、SE33、AR和D9S112，为精确检测，vWF微卫星标记的PCR产物经AluI酶切。7%的聚丙稀酰胺凝胶电泳，Marker采用pBR322/HaeⅢ。银染。
2 结果
2.1 SSCP结果
多个异常中，一例 外显子8 表现如图1所示：患者的祖母、外祖父、外祖母、母亲、妹妹均显示正常，患者的单链位置明显与家人不同，而患者的父亲、祖父则出现4条带，其中两条与正常的位置表现相同，另外两条则与患者的两条位置相同。
2.2 序列分析
将上述家系的患者、患者父亲、母亲、祖父及一例正常人的 外显子8 测序，并与GENEBANK中的ATP7B基因序列对比(图2), 发现: (1)患者2 250位点发生C→G突变，即发生在密码子770 上，此突变为同义突变; 在2 273位点发现G→T，发生Arg 778 Leu突变，此突变为错义突变。患者上述两个突变同时存在; (2)患者父亲在2 250位点的C及G碱基同时存在于同一位置，在2 273位点，G及T碱基同时存在于同一位置; (3)患者祖父的序列与患者父亲完全相同; (4)患者祖母、外祖父、外祖母、母亲、妹妹均示正常序列。
由上述结果结合SSCP结果不难看出, 患者属纯合子，其父为杂合子，母亲为正常。
图1 肝豆状核变性家系PCR-SSCP检测结果
a.祖父;b.祖母;c.外祖父;d.外祖母;e.患者;f.父亲;g.母亲;h.妹妹。
图2 肝豆状核变性家系放射自显影序列分析
2.3 亲子鉴定
亲子鉴定共检测4个微卫星DNA标记：vWF、SE33、AR和D9S112，其基因型见表1。亲子鉴定结论：实验所用4个微卫星DNA 的累积非父排除率为0.999，病人与父母之间符合遗传规律，父母作为病人的生身父母的亲权相对机率为99.99%。可以认定该家系的血缘关系。
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