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中国成都地区汉族人群DHFRP2位点的遗传多态性研究 |
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l，10ng DNA，0.1μmol/L 每种引物，200μmol/L dNTP，5μl 10×反应缓冲液，1.5U Taq酶和1.5mmol/L的 MgCl2，PCR反应条件：94℃ 30s, 62℃ 30s, 72℃ 40s, 30个循环后72℃延伸5分钟。
1.3.3 电泳分离 用T=10%, C=5%, 含4 mol/L尿素的丙烯酰胺凝胶，凝胶长度为20cm，1×TBE作电泳缓冲液，取2μl扩增产物加1μl载样缓冲液上样，以pBR322/MSPI作分子量标准，恒电压650V电泳，当二甲苯氰蓝迁出8cm左右，停止电泳。
1.3.4 银染 按Bassam等人的方法进行〔2〕。
1.3.5 用机算机DNA图像自动分析软件（Bio-Rad）计算pBR322/MSPI的迁移规律，得到等位基因片段长度，按国际法医血清及遗传学会DNA委员会(The DNA commission of the international society of forensic haemogenetics, ISFH) 的命名原则命名〔3, 4〕。
1.3.6 等位基因Ladder 将选出的各等位基因混合，1 : 1 000稀释后扩增得到等位基因Ladder。
1.3.7 DNA测序 将扩增后得到的等位基因1 : 1 500稀释，扩增、电泳分离，溴化乙锭染色，紫外灯下切下目的片段，用“压碎与浸泡”法〔5〕纯化、回收DNA。酚-氯仿抽提回收DNA，取5μl产物进行测序。
1.3.8 统计学分析 采用χ2检验验证各基因型的观察值和期望值是否符合Hardy-Weinberg平衡。个人鉴别力（DP）按Fisher公式〔6〕计算。无偏倚估计期望杂合性（h）按Nei公式〔7〕计算。多态性信息量（PIC）按Botstein公式〔8〕计算。非父排除率（CE）按公式计算：
2 结果与讨论
156个无关中国成都地区汉族个体中发现6个等位基因（表1，图1），最常见的等位基因为A7（167bp）。首次发现一新等位基因A9.2, 测序显示其片段长度为177bp，观察到19种基因型（表2）。χ2检验表明其分布符合Hardy-Weinerg平衡（χ2=13.6,df=18,P>0.5），个体鉴别力为0.87，期望杂合性为71.4%，观察杂合性为67.3%，多态性信息量为0.68，非父排除率为45.5%。10个家系（一个三代8口，9个二代3口）调查结果表明，该位点符合孟德尔遗传规律（图2）。将等位基因Ladder用Bio-Rad图像分析软件分析，结果见图3。等位基因A9.2测序结果见表3。
图1 156个无关中国成都汉族个体中发现的DHFRP2位点等位基因从左至右基因型为：10-10, 9-9.5, 8-8, 7-7, 6-6。
图2 一个两代三口人家DHFRP2位点的扩增结果从左至右基因型为：8-9.5, 6-9, 9-9.5(负极在上)。
短串联重复序列（STR）是一种广泛分布在人类基因组中的DNA片段，据估计，在人类基因组中，每20Kb就含有一个STR位点〔10, 11〕。近年来的研究表明，有众多的STR位点具有多态性，使之成为一个很好的遗传标记。因STR位点具有扩增效率高和判型准确等优点〔12〕，得到了法医遗传学者的广泛应用。本研究用PCR、高分辩率PAGE和高灵敏度的银染方法，对DHFRP2位点分型获得成功。
No 1 2 3 4 5 6
Allele A10 A9.2 A9 A8 A7 A6
Size 179.35 177.30 174.70 170.76 167.46 163.21
图3 DHFRP2位点等位基因Ladder的分析图谱（Bio-Rad图像分析软件）
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