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高渗刺激诱导大鼠下丘脑室旁核和视上核神经激肽B受体阳性神经元表达Fos |
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以往的研究表明，NKB/NK3受体在机体水盐代谢和渗透压调节中起着重要的作用。如脑室内注射NKB或NK3受体的激动剂可引起动物血压升高并抑制对盐的摄取，同时可引起下丘脑释放加压素［4～6］。c-fos作为即刻早期基因家族的成员，它的表达常被认为是神经元被激活的标记而广泛应用于神经科学的研究领域。以往文献证实，静脉内注射高渗盐水可使机体处于高渗环境并可诱导下丘脑室旁核和视上核等与渗透压调节有关的脑区表达c-fos［7，8］，说明c-fos表达亦可应用于渗透压调节神经通路的研究。因此，为研究下丘脑室旁核和视上核NK3受体与机体渗透压调节之间的关系，本研究采用免疫双标记技术，观察了高渗条件刺激下大鼠下丘脑室旁核和视上核内NK3受体阳性神经元的Fos表达情况。
材料和方法
实验共用成年SD大鼠6只。在腹腔内注射戊巴比妥钠(40 mg/kg)麻醉下，将含有0.9%肝素的塑料管插入颈外静脉并用丝线固定，该管在皮下沿颈部绕至大鼠的背部。动物存活3d后，通过塑料管将等渗的0.15 mol/L的生理盐水(2只)或1.5 mol/L的高渗盐水(4只)缓慢注入颈外静脉(5.5 ml/kg)［7］。在操作过程中，动物处于自由活动状态，未见明显不适反应。90 min后，在腹腔注射戊巴比妥钠(100 mg/kg)的深麻醉状态下，开胸经升主动脉插管，先用100ml生理盐水冲净血液，然后用500 ml含4%的多聚甲醛和0.5%的苦味酸的0.1 mol/L磷酸缓冲液(PB，pH7.4)灌注固定，灌毕取全脑，然后置于含有30%的蔗糖的0.1 mol/L PB(pH7.4)过夜。取含下丘脑的脑块，冰冻冠状切片，片厚15 μm。切片先用PAP法进行NK3受体免疫组织化学反应，然后用ABC法进行Fos免疫组织化学反应。切片经0.01 mol/L的磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.4)漂洗后，依次进入兔抗大鼠NK3受体多克隆抗体(0.8 μg/ml，关于此抗体的制备和鉴定请参照文献［9］)孵育过夜；羊抗兔IgG(Vector,1∶50)4h；PAP复合物(Sigma,1∶100)2h。其中一抗和二抗用含1%的正常驴血清和0.3%的Triton X-100的0.01 mol/L PBS(pH7.4)稀释，PAP复合物用含0.3%的Triton X-100的0.01mol/L PBS(pH7.4)稀释。切片最后在含有0.05%DAB和0.003%的H2O2的0.05 mol/L Tris-HCl缓冲液(pH7.6)内呈色20～30 min。NK3受体免疫反应产物呈棕褐色。免疫染色后的切片经0.01 mol/L PBS(pH7.4)漂洗30 min，然后用ABC法进行Fos免疫组织化学染色。切片首先进入羊抗Fos血清(Cambridge,1∶3 000)孵育过夜，然后依次进入生物素标记的驴抗羊IgG(Jackson,1∶100)2h和ABC复合物(Vector,1∶50)1h。最后切片经H2O2/DAB/硫酸镍胺呈色，Fos阳性胞核为黑色。
对照实验在省略一抗、或用正常兔血清代替兔抗NK3受体抗体、或用羊血清代替羊抗Fos血清的情况下进行，结果为阴性。
结果
在注射0.15 mol/L等渗生理盐水的大鼠，有一定数量的Fos阳性神经元恒定出现于大脑皮质(包括梨状皮质、运动和感觉皮质)、下丘脑的视前区、下丘脑外侧区和丘脑室旁核。视上核的主部内有个别散在分布且染色浅淡的Fos阳性细胞(＜3个细胞/切片)，但下丘脑室旁核、视上核的视交叉后部及下丘脑的其他区域为阴性。给予高渗刺激大鼠的Fos免疫染色发现，除大脑皮质和下丘脑视前区等脑区外，大量浓染的Fos阳性细胞出现于下丘脑的室旁核和视上核内。Fos阳性细胞主要位于室旁核的后大细胞部和视上核的主部，少量散在分布于视上核视交叉后部和室旁核的小细胞部。此外，还有一定数量聚集成团的Fos阳性细胞出现于下丘脑前部的圆形核和血管周围。
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