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听源性惊厥发作后中脑导水管周围灰质内c |
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1 mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.4，4℃)灌注固定。脑组织块在相同固定液中后固定24h，4℃。常规脱水、透明，石蜡包埋，冠状连续切片，厚10 μm。分两套裱于涂有铬矾明胶的载片上。1套作克紫(Nissl)染色，另1套作免疫细胞化学染色。
2. 免疫细胞化学方法
3组切片经二甲苯脱蜡、0.01 mol/L磷酸盐生理盐水缓冲液(PBS，pH7.4)漂洗后，室温下依次入含0.3% Triton X-100的0.01mol/L PBS、含0.3% H2O2的纯甲醇(封闭内源性过氧化物酶)及2%正常羊血清(抑制非特异性IgG的结合)各30 min；之后入兔抗Fos的多克隆抗体(1：150，Santa Cruz)，4℃孵育24h；再依次入生物素结合的羊抗兔IgG(1：200,Vector)和卵白素-生物素-过氧化物酶复合物(ABC)(1∶100，Vector)中各孵育1.5 h，室温；以上各步骤之间均以0.01 mol/L PBS充分漂洗。最后以含0.01% H2O2的0.04% DAB(二氨基联苯胺，TCI)溶液呈色5～10 min，随时镜检并及时以0.01 mol/L PBS终止反应。切片经0.01 mol/L PBS充分漂洗后，常规脱水透明，中性树胶封片。每组的对照切片不加兔抗Fos抗体孵育，其余步骤相同。
3. Fos阳性神经元百分率的计算
每只大鼠的PAG冠状连续切片由首侧向尾侧每隔150 μm取片，其中背盖背侧核至滑车神经核尾端之间的切片归入PAG尾侧段，滑车神经核至动眼神经核上端之间的切片归入PAG中段，后连合至室旁灰质间的切片归入PAG首侧段［3］；这样，每只大鼠共观察约15张切片，其中尾侧段3张，首侧段2张，中段10张［3］。然后以目镜正方网格测试系统在明视野显微镜(400倍)下测量每张切片PAG各亚区0.0225 mm2面积内的Fos阳性神经元数，以此作为该亚区Fos阳性神经元的密度，各节段各亚区的测量部位保持一致以减小人为误差；以相同方法计数相邻Nissl切片上相同部位0.0225mm2面积内神经元剖面的数量作为该部位的神经元密度。Fos阳性神经元密度与Nissl切片神经元密度的比值即为该部位的Fos阳性神经元百分率。然后以方差分析检验各组Fos阳性神经元百分率之间的差异。
结 果
1. NW组PAG内的Fos阳性神经元
正常Wistar大鼠接受1次铃声(106dB,60s)刺激后，PAG背侧亚区、背外侧亚区和尾侧段腹外侧亚区内仅观察到个别散在的Fos阳性神经元，其阳性百分率见附表。
2. NP组PAG内的Fos阳性神经元
在没有接受铃声(106dB,60s)刺激的P77PMC大鼠的PAG背侧亚区、背外侧亚区和尾侧段腹外侧亚区内同样仅观察到个别散在的Fos阳性神经元，其阳性百分率见附表。
3.PS组PAG内的Fos阳性神经元
听源性惊厥易感大鼠(P77PMC)在接受铃声刺激(106dB,60s)的第30～40s时出现惊厥发作，持续大约30～40s。听源性惊厥发作后的第2h，在PAG内可见广泛的c-fos表达。Fos阳性产物为棕黄色细颗粒状，位于细胞核内。在PAG尾侧段，Fos阳性神经元主要分布在腹外侧亚区，中缝核团内亦可见少量阳性神经元(图1，图5A)；在中段，Fos阳性神经元集中成簇分布在背侧亚区及背外侧亚区内，而腹外侧亚区内的Fos阳性神经元则由尾侧向首侧逐渐减少直至消失；中段还可见少量散在的阳性神经元勾勒出中缝核团的轮廓(图2，4；图5B，C)；在首侧PAG水平，Fos阳性神经元集中分布在后连合内下方的背侧亚区内(图3，图5D)。PAG各亚区各节段内Fos阳性神经元的分布情况以及Fos阳性神经元百分率见图5和附表。
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