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听源性惊厥易感大鼠中脑导水管周围灰质内突触素的表达 |
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体重350～450g。共分3组，即NW组(normal Wistar rats,n=4)：正常Wistar大鼠；NP组(naive P77PMC rats,n=4)：未受处理的听源性惊厥易感大鼠；KP组(kindled P77PMC rats,n=4)：听源性惊厥点燃后的P77PMC大鼠。
3组动物以复合麻醉剂(chloropent, 3 ml/kg)腹腔注射麻醉后，经左心室-升主动脉插管，室温下灌注生理盐水100～150 ml，随后灌注含4%多聚甲醛的0.1 mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.4，4℃)300ml。脑组织于相同固定液中后固定24h，4℃。常规脱水，透明，石蜡(54～56℃)包埋。自延髓上段至缰连合作10 μm厚的冠状连续切片，裱于涂有铬矾明胶的载片上。
3. P38免疫细胞化学方法
3组切片经二甲苯脱蜡、0.01 mol/L磷酸盐生理盐水缓冲液(PBS，pH7.4)漂洗后，室温下分别入含0.3% Triton X-100的0.01 mol/L PBS、含0.3% H2O2的纯甲醇(封闭内源性过氧化物酶)及2%正常马血清(抑制非特异性IgG的结合)各30 min；之后入小鼠抗P38单克隆抗体(1∶200，Sigma)，室温1h，之后入4℃冰箱，24h。再依次入生物素结合的马抗小鼠IgG(1∶200,Vector)和卵白素-生物素-过氧化物酶复合物(ABC)1∶100，Vector)中各孵育1.5h，室温。以上各步骤之间均以0.01 mol/L PBS充分漂洗。最后以含0.01% H2O2的0.04%DAB(二氨基联苯胺，TCI)溶液呈色5～10 min，常规脱水透明、中性树胶封片。阴性对照切片以0.01 mol/L PBS代替小鼠抗P38单克隆抗体，其余步骤相同。
4. 观察与分析
4.1 定性观察：在明视野显微镜下观察P38免疫反应产物的形态特点及其在PAG各亚区内的分布特点。
4.2 P38免疫反应产物在PAG各亚区分布的定量分析：突触素P38免疫反应产物的标记强度以光密度(optic density，A)值来表示。每只大鼠的PAG冠状连续切片，每隔150 μm取片，共取约15张切片(其中首侧段2张，尾侧段3张，中段8张)，以计算机图像分析系统(Leica, Q550IW)测量每张切片左右两侧PAG各亚区内P38免疫反应产物的光密度值；由于内侧纵束和上、下丘连合几乎不着色，故每张切片以此处的光密度值作为背景值，各亚区光密度值减去背景值即得到校正光密度值(corrected optic density,CA),进行统计分析时采用此校正光密度值，以消除非特异性着色对结果的影响。最终每组大鼠PAG的每个亚区共得到120个CA值。各组的CA值以SPSS for Windows统计分析软件进行单因素的方差分析(one-way ANOVA)。
附表 各组大鼠PAG内P38免疫反应产物的CA值(×100)
Table CA value of P38 immunoreactivity in PAG in rats of groups(×100)
NW NP KP ANOVA
NW NP KP
内侧亚区
medial subdivision 2.06±0.99 2.87±0.89 3.50±0.73 A B B
腹外侧亚区
ventrolateral subdvision 1.75±0.62 3.17±1.19 4.00±1.35 A B B
背侧亚区
dorsal subdivision 1.92±0.67 3.17±0.94 5.58±1.73 A B C
背外侧亚区
dorsolateral subdivision 1.38±0.74 2.90±0.75 4.88±1.81 A B C
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