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基底前脑NOS神经元移植至成年鼠海马内的发育 |
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mmpus.
【Key words】 Nitric oxide synthase; Transplantation; Hippocampus; Basal forebrain; Rat
神经系统的NO在生理条件下可调节脑血流量，调制痛觉，既可发挥神经递质的作用，又可作为神经调质促进递质的释放［1］，并参与突触可朔性［2］，导向轴突生长［3］。在长时程增强和长时程抑制，学习与记忆和神经发育中也发挥重要作用［4］。由于NO性质活泼半衰期短，故研究中多用观察NOS的变化来了解NO的作用［5］，基底前脑(BF)是NOS阳性神经元较集中的主要脑区之一，基底前脑的内侧隔核和斜角带核内的NOS阳性神经元绝大部分都是胆碱能神经元［6］，用基底前脑胆碱能神经元移植以治疗学习记忆减退已是较为常用的研究方法，但是NOS阳性神经元在此移植后的生长发育规律以及可能的作用尚不清楚，本实验对这一问题进行了研究。
材料和方法
1. 实验动物
雄性SD大鼠40只，3～5个月龄，体重250～350g，分为8个时间组，分别在单侧穹窿海马伞(fornix-fimbria,FF)损伤术1周后进行移植。移植后动物分别经5、7、14、30、60、90、150和180d存活，灌注后取脑，共分8组，每组5只动物。
2.穹隆海马伞(FF)切断术
动物经腹腔注射麻醉后，置于鼠脑立体定位仪上，参考Paxon和Watson的大白鼠脑立体定位图谱，在前囟后2 mm，中线左侧1 mm处，用自制手钻打开颅骨。将双刃刀先置于前囟后2 mm，中线左侧1 mm的脑表面，接着降刀4.1 mm，并向外移1 mm，向内移0.5 mm，然后再降刀1 mm，并向外移1.5 mm，依次切断胼胝体缘，扣带回，背侧穹隆，穹隆及海马伞。
3. 细胞悬液制备
在细胞培养室内，无菌操作下打开孕鼠腹腔，从子宫远角端逐一取出胚胎，14～16d胚胎头臀长12～16 mm，将胚胎放入加有基础培养液的培养皿内，断头，分离出隔及斜角带区的组织，用0.125%胰蛋白酶消化组织块，制成单个神经元悬浮液，用200目77 μm钢网过滤，以除去悬浮液中的小血管及小束结缔组织，然后取1 μl细胞悬液加入台盼蓝作活细胞百分比计数。细胞悬液内细胞密度为3～4万个／μl，活细胞率为85%～97%。
4. 移植手术
FF损伤后1周，将细胞悬液移植入损伤侧海马内，共3点，每点移植坐标分别为(1)前囟后(A)=+3.0mm，中线左侧(L)=2.0mm，硬膜下(V)=3.5mm；(2)A=+4.5，L=3.5mm，V=3.6mm；(3)A=+6.0mm，L=3.7mm,V=3.7mm。每点移植4μl。
5.组织切片制备
移植动物在深麻醉下，经左心室主动脉插管，冷多聚甲醛磷酸缓冲液(pH7.4)内含15%(v/v)的饱和苦味酸固定液，350 ml灌注固定，后固定2h。再转入30%蔗糖磷酸缓冲液中，4℃下过夜直至其沉底。冰冻切片机切片，厚40 μm，连续取4套切片，取其中两套做Nissl和NOS染色。
6. NOS染色和Nissl染色
6.1 NADPH-d组织化学染色：NADPH-d染色孵育液为：(1)0.1 mol/L磷酸缓冲液(pH8.0)；(2)1 mmol/L 氯化硝基四氮唑蓝(NBT);(3)1.2 mmol/L β-NADPH-d(Sigma)；(4)0.1% Triton X-100。临用前配制。组织切片用漂浮法孵育，入孵育液前用0.1 mol/L PB(pH7.4)洗2次，各5 min。在孵育液中37℃反应1h，用0.1 mol/L PB(pH7.4)终止反应。裱片，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。
6.2 Nissl法染色：组织玻片入0.25%焦油紫染液(每30 ml0.25%焦油紫水溶液加10%醋酸5滴)反应3～5 min。95%酒精分色，无水酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。
结 果
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