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以HRP及氚水作示踪剂研究脑脊液的回流途径 |
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cosa nasi; Peripheral space of fila olfactoria
脑脊液(cerebrospinal fluid,CSF) 的生成、吸收与脑的血液循环有着密切关系。CSF循环一直受到国内外神经科学工作者的关注。长期以来，人们在这一领域做了大量研究工作［1～12］。CSF循环障碍可导致一系列急慢性中枢神经系统功能紊乱，因此，对CSF及其循环进行研究，不仅具有重要的理论意义，而且具有重要的临床意义。
目前国内外研究资料［1～5］表明，关于CSF的循环途径尚未形成统一意见。
本实验分别采用HRP及氚水作为示踪剂，运用光镜、酶标电镜、液闪计数、放射自显影技术，对CSF回流途径进行了研究，以完善CSF循环的概念。
材料和方法
选用成年健康Wistar大白鼠50只(150～250g)，雌雄不拘。经2%戊巴比妥(0.5 ml/100g)腹腔注射麻醉。继而在定位仪上将其固定于耳杆平面。经前囟旁1.5 mm打孔，垂直进针3.5 mm进入侧脑室，分别用HRP和氚水作为示踪剂或生理盐水作为对照剂注入其中。
1. 以HRP为示踪剂研究CSF回流途径的光、电镜标本制作过程
健康成年雌、雄性Wistar大白鼠16只，分为实验组14只，对照组2只。将20 mg HRP(中国科学院上海生化所东风生化技术公司生产)溶解于0.1ml蒸馏水中，15～30 min缓慢注入实验组大白鼠侧脑室。推注结束30min后，断颈处死大白鼠，迅速开颅、并将头部置于-18℃的丙酮中。冷冻后解剖出完整的脑，于-18℃的温度下，在恒冷切片机内作正中矢状切和偏正中矢状切，取鼻中隔作矢状切和水平切，切片厚度均为30 μm。切片在室温中干燥。后置于含2%多聚甲醛-戊二醛的0.1 mol/L磷酸缓冲液中漂洗3～4h。漂洗后的切片在加入50 mg DAB的100 ml Tris-HCl液中孵育10 min，pH7.6， 4℃。在孵育液中加入0.33%的H2O2 1 ml,20℃，继续孵育15 min。迅速用蒸馏水冲洗切片，苏木精复染，树脂封片。
对照实验将生理盐水注入侧脑室，其余实验步骤同实验组。电镜标本的制作则是将HRP注射完毕，动物处死后，取其脑垂体、松果体、鼻中隔，恒冷切片(片厚30 μm)。将上述组织切片与侧脑室脉络丛一道固定、漂洗、孵育，方法同光镜。然后用0.1mol/L磷酸缓冲液冲洗，再移入1%锇酸中固定、染色，经梯度酒精和丙酮脱水等步骤后，环氧树酯801包埋，超薄切片，透射电镜下观察、摄片。
2. 以氚水作为示踪剂研究CSF回流途径
成年健康雌、雄性Wistar大白鼠20只，实验组15只，对照组5只。实验组大白鼠经侧脑室注入5 μl氚水(1 mci/ml)，注射时间为5～10 min,注射结束后立即处死实验动物。在恒冷切片机上进行脑正中、偏正中矢状切，切片厚度3～5 μm。切片经酒精蒸气固定，涂布火棉胶保护层，于暗室内涂布核乳胶。待乳胶阴干后收入曝光盒中，在-4℃干燥条件下曝光，时间为15～30d。曝光完毕后显影、定影、水洗，最后用苏木精复染，树脂封片。
对照组注射生理盐水进入大白鼠侧脑室，其余步骤同实验组。
3. 液闪计数实验
成年健康雌、雄性Wistar大白鼠14只，实验组对照组各7只。将5 μl氚水注入实验大白鼠侧脑室后，处死大白鼠，解剖出脑组织，分别取其脉络丛、脑垂体、松果体、最后区并称重。将上述标本分别置于闪烁测量杯中，加入高氯酸0.1 ml作为消化剂，30%H2O2 0.2 ml作为脱色剂，放置于80℃的恒温水浴箱内消化1h。消化后加入POPPO闪烁液5 ml，进行匀相液闪示踪测定。
对照组除侧脑室注入生理盐水外，其余步骤同实验组。
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