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猕猴消化系统各器官蛋白水解酶种类和性质研究 |
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白水解酶的研究还较少，而系统研究猕猴消化系统各器官蛋白水解酶的种类和性质，尚未见报道。
活性电泳方法始建于本世纪70年代，具有直观、简便、灵敏性高、电泳后仍可保持蛋白质和蛋白酶生物活性等优点［7］。除定性分析外，可用摄像扫描密度计定量测定酶活性区域的透光值，计算机可根据透光值，计算出相应含量。我们用活性单向电泳(1D-G-PAGE)和活性双向电泳(2D-G-PAGE)方法对猕猴消化系统各器官中蛋白水解酶的种类、性质及pH依赖性进行了研究，以期探讨消化系统中蛋白水解酶的变化规律，并对其与消化系统各脏器生理功能间的可能关系进行了讨论。
材料和方法
1. 材料
系河南师范大学生物系猕猴饲养场提供的正常雄性成年太行山猕猴，实验用猕猴共3只。所取脏器包括舌、食管上段、食管中段、食管下段、胃贲门、胃体、胃幽门、十二指肠、空肠、回肠、盲肠、结肠、直肠、腮腺、颌下腺、舌下腺、肝和胰脏等。
2. 主要化学药品
丙烯酰胺(acrylamide, Sigma公司)、双丙烯酰胺(bisacrylamide, Fluka公司)、N，N，N′，N′-四甲基乙二胺(TEMED，Bio-Rad公司)、明胶(gelatin, Sigma公司)、曲拉通X-100(Triton X-100，Farco公司)、十二烷基磺酸钠(SDS，Serva公司)、牛血清白蛋白(BSA，Sigma公司)、三羟甲基氨基甲烷(Tris-base,上海巴斯生物公司)、标准分子量蛋白(Serva公司)、考马斯亮蓝R-250(Coomassie Brillant blue R250, Fluka公司进口分装)、两性电解质(ampholyte，军事医学科学院)、乙基苯基聚乙二醇(nonidet P40，Fluka公司)。
本实验所用其他化学药品均为分析纯。
3. 制备组织匀浆液
取猕猴消化系统各器官，冰浴匀浆，4℃离心(20 000g, 5 min)，分装上清液，保存于液氮中备用。
4. 蛋白质浓度测定
采用Neuhoff方法［8］。
5. 活性单向电泳(1D-G-PAGE)
按徐存拴改良的方法［9］进行。将0.083%的明胶共聚于10%聚丙烯酰胺凝胶里，电泳在4℃进行，样品在浓缩胶里电泳时，电压为50V，初始电流强度10 mA／板；样品在分离胶里电泳时，电流强度同上，电压≤100 V。待前沿指示剂(1%溴酚蓝)到达离胶板下缘2cm处时停止电泳，切除前沿指示剂以下部分后，将凝胶板放入胶板洗涤液(3.03g Tris-base，12ml Triton X-100，500ml双蒸水，pH6.5，20℃)中30min，每5min振荡1次，洗涤后，将胶板放入双蒸水中洗涤3次(5min／次)，然后将胶板置37℃(0.1mol/L glycin，5mmol/LCaCl2，pH分别是：3.5、5.9、7.0、10.5)，24h后，按Laemmli方法［10］固定、染色、脱色至酶活性区域清晰透亮(使用用过多次的旧脱色液脱色，效果更佳)。使用不同pH值的孵育液处理胶板可以进行蛋白水解酶的pH依赖性检测。
6. 活性双向电泳(2D-G-PAGE)
以O′Farrell［11］(1977)IEF-SDS-PAGE方法为基础进行改良。用于等电聚焦(IEF)的凝胶里不含DTT，样品缓冲液的尿素浓度≤5mol/L。电泳在4℃进行，电压250V，电流12h。等点聚焦结束后，胶条在洗涤液(80mmol/L Tris-Cl、2%SDS,pH6.8)里洗涤10min，然后将胶条预夹入离胶液槽上沿和左侧各1cm处的胶液槽(胶液槽厚1mm)里，把分离胶液注入胶液槽待凝固后，将上述洗涤液注入胶液槽内洗涤胶条2次(5min／次)，然后将洗涤液倒掉，用0.5mol/L Tris-Cl，pH6.8的缓冲液洗涤2次，之后把浓缩胶液注满整个胶液槽，其余步骤同1D-G-PAGE。
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