|
人酪氨酸羟化酶RNA探针制备的研究 |
| |
(BIO 101)对其进行纯化，即先将切割下来的带有DNA片段的琼脂糖凝胶在50℃溶解于NaI中，以GLASSMILK吸附溶液中DNA，用缓冲液冲洗3次去除杂质后，再将DNA在50℃溶解于水中得到纯化的3.199kb和1.832kb的DNA片段。然后将3.199kb片段在50℃条件下进行去磷酸化反应(1h)，经常规抽提后溶解于水中，得到去除磷酸化的3.199kb DNA片段；将上述纯化的1.832kb DNA片段和去磷酸化后的3.199kb的DNA片段按等摩尔浓度混合。加入T4连接酶(PROMEGA) 3个单位在16℃条件下行连接反应16h；以CaCl2法将大肠杆菌XL－1 Blue制备成感受态细胞，加入经连接反应后的混合物冰浴45min，再通过热休克法使DNA进入感受态细胞；将这些细胞悬浮培养在LB(PROMEGA)培养液中，37℃，1h，然后铺在含氨苄青霉素(AMP，5g/L)的LB琼脂培养基上，37℃，16h，共得到63个菌落。
在培养基上随机取12个菌落，分别置入含有5 ml LB和AMP的12支长试管(20 ml)中进行悬浮培养(37℃，16h)；用煮沸法小量从细菌中提取质粒；将培养物离心收获细菌，重悬于STET中，加入溶菌酶(10g/L)，混匀后于100℃水浴中加热40s以裂解细菌；离心收集富含DNA质粒的上清液并用常规方法进行沉淀，将12个试管中提取的质粒DNA用限制性内切酶EcoRI消化(37℃，1h)在1%琼脂糖凝胶上进行电泳，以确定拟构建的质粒是否符合设计要求。
经确定为pGEMTH2质粒后，用碱裂解法大量制备这些质粒，即将100ml菌液离心沉淀，收集出细菌重悬于溶液I(50mmol/L葡萄糖，250mmol/L Tris pH8．0,10mmol/L EDTA pH8．0，溶菌酶10g/L)中，加入溶液Ⅱ(0.2mol/L NaOH,1% SDS)和溶液Ⅲ(3mol/L醋酸钾)裂解细菌；离心收集富含质粒DNA的上清，酚/氯仿抽提，去除蛋白杂质，常规方法沉淀DNA，这样，100ml菌液可得到300μg pGEMTH2质粒。
2. RNA探针的制备
将上述所制备的pGEMTH2质粒用限制性内切酶XhoI在37℃温度下进行消化，用GENECLEAN药盒纯化，收集TH基因片段；对此片段在绝对无RNA酶的条件下用地高辛RNA标记药盒进行转录标记反应(总体积20μl,37℃,2h)，反应体系中含10mmol/L DTT,RNA酶抑制剂20U，ATP，CTP，GTP各1mmol/L, UTP 0．65mmol/L及有地高辛标记的UTP 0.35mmol/L,1．0μg的人TH线性DNA模板和30U的RNA聚合酶37℃ 2h。用限制性内切酶SmaI 25℃消化30min，然后用pH8．0的EDTA 20mmol/L终止反应，加1/10体积的4mol/L LiCl和3倍体积的无水乙醇，在-70℃下，30min沉淀探针，用75%冷乙醇洗涤2次，最后溶解于DEPC处理过的水中，加入RNA酶抑制剂(10IU/L)分装于小试管中，在-80℃下储存。
3. 地高辛标记探针的杂交与检测
参照文献［3］进行斑点杂交。
先将含有探针序列的质粒pGEMTH2和phTH2加热变性，用DEPC处理过的水进行稀释(稀释浓度为1g/L，0.1g/L和0.01g/L)，然后将稀释的DNA按不同浓度梯度点于尼龙膜上，固定DNA，将膜置于80℃，2h。进行预杂交42℃摇动2h，预杂交液中含有0.75mol/L NaCl,0．1%N－十二烷基肌氨酸，0.02%SDS和1%BSA。在上述体系中加入人TH RNA地高辛标记探针(10μg/ml)进行杂交，在42℃摇动16h，杂交后依次用2×SSC和0.1×SSC洗涤各15min，再用缓冲液洗涤1次。缓冲液中含有0.15mol/L NaCl,100mmol/L Tris－HCl(pH7．5)。用3%BSA封闭非特异性抗原，加地高辛抗体(1∶5 000)室温下温育2h，洗涤后用NBT－BCIP室温显色10min。
上一页 [1] [2]
上一个医学论文： 葡萄糖调节蛋白94在人胚胎发育中的表达
下一个医学论文： SD乳鼠窦房结细胞原代分散培养的光电镜研究
|
|
|
|
|
|
|
您现在的位置： 绿色健康网 >> 医学论文 >> 基础医学论文 >> 正文