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人酪氨酸羟化酶RNA探针制备的研究 |
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李淑婷 杨慧 张进禄 蔡青 徐群渊
【摘要】 目的 制备地高辛标记的人酪氨酸羟化酶(hTH2)cRNA探针。 方法 用分子克隆技术重组质粒pGEMTH2。用体外转录法制备地高辛标记hTH2cRNA探针，经限制性内切酶分析，显示重组质粒含有酪氨酸羟化酶基因片段，且插入位点正确。使用斑点杂交证实我们制备的探针是敏感而可靠的。 结果 杂交阳性部位呈紫蓝色，深浅与稀释度成正比。 结论 Dig标记的hTH2cRNA探针有较好的敏感性和可靠性，可用于基因治疗帕金森病动物模型基因表达的研究。
【关键词】 人酪氨酸羟化酶基因 质粒pGEMTH2 地高辛精标记RNA探针 斑点杂交
PREPARATION OF A RNA PROBE FOR HUMAN
TYROSINE HYDROXYLASE
Li Shuting, Yang HuiΔ, Zhang Jinlu, Cai Qing, Xun Qunyuan
(Beijing Institute for Neuroscience,Capital University of Medical Sciences,Beijing)
【Abstract】 Objective To prepare a digoxingen－labelled cRNA probe for human tyrosine hydroxylase(hTH2).Methods Using molecular cloning techniques the recombinant plasmid pGEMTH2 was constructed.According to analysis of restriction endonucleases,the pGEMTH2 contained the DNA fragment of hTH2 gene and inserting sit preparation was correct for cRNA－probe.From recombinant plasmid pGEMTH2 prepared cRNA probe was identified by dot blot hybridization.Results The dot blot hybridization showed that the positive reaction sites were purple－blue.Conclusion This probe prepared in present study was sensitive and reliable.This probe might provide a tool for identifying the effect of gene therapy in animal model of Parkinson disease.
【Key words】 Human tyrosine hydroxylase; pGEMTH2; Dig－labeled RNA probes; Dot blot hybridization
在基因治疗帕金森病(Parkinsion disease,PD)的实验研究中，人们应用再生成左旋多巴(L－dopa)和多巴胺(dopamine,DA)这一生化反应中起关键作用的限速酶——酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)基因，做为目的基因所进行的一系列的研究取得了一些进展［1，2］。但是，这些研究多局限于大鼠模型，灵长类动物模型基因治疗的研究工作还刚刚开始。针对目前正在进行的基因治疗PD灵长类模型实验研究中，应用原位杂交方法检测TH基因的体内表达水平的需要，合成可靠和实用性强的人THRNA探针应有重要实用意义。
材料和方法
1. 质粒pGEMTH2的重组
方法主要参照《分子克隆实验指南》［3］
将质粒pGEM－3zf(华美公司)和质粒phTH2(美国Somatix Therapy Corporation)分别用限制性内切酶EcoRI在37℃下消化1h，得到线性化的质粒pGEM－3zf和不同的DNA片段；对酶切后的DNA片段行1%琼脂糖凝胶(上海生化试剂公司进口分装)电泳并取下来自质粒pGEM－3zf的3.199kb片段和来自质粒phTH2的1.832kb片段；用GENE－CLEAN药盒[1] [2] 下一页
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