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葡萄糖调节蛋白94在人胚胎发育中的表达 |
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o;子宫切除术”获得的胎儿。根据停经时间、B超胎儿双顶径及胎儿顶臀长度确定胎龄，分别为10、11、12、18(n=2)、20、28、29+4、31+2周，按胎龄分为发育早期(10～12周)、中期(18～20周)和晚期(28～31+2周)进行分组观察。
2. 试剂
GRP94单抗为鼠抗鸡输卵管GRP94的抗体(Ig2α)，美国ABR公司产品。广谱SP免疫组织化学试剂盒为福州迈新公司产品，生物素标记的第二抗体适用于鼠和大鼠来源的单抗以及兔来源的多抗。DAB为Sigma公司产品。
3. 方法
迅速剖取胎儿组织(结肠、肾、肝、胃、肺、心肌、骨骼肌、脊髓及胸腺)固定于10%福尔马林中，石蜡包埋，连续石蜡切片(5μm)，置于涂有多聚赖氨酸的载玻片上，用于HE染色及SP法免疫组织化学染色(同时设立不加一抗的阴性对照)。
染色过程如下：切片常规脱蜡至水化。组织抗原微波修复，于0.01mol/L枸橼酸盐缓冲液(pH7.6)中，微波炉加热至微沸并持续5～10min。用3%H2O2室温孵育10min，封闭内源性过氧化物酶；10%非免疫动物血清，37℃，30min以阻断非特异性反应。加第一抗体(GRP94抗体，工作浓度为1∶400)37℃孵育2h，加生物素标记的第二抗体，37℃，30min，最后加链霉亲合素－过氧化物酶复合物，37℃，20min(各步间需0.1mol/L PBS漂洗)，经H2O2－DAB呈色(100ml 50mmol/L Tris－HCl(pH7.4)缓冲液中含DAB 50mg、H2O233μl)3～7min。苏木素复染、脱水、透明及封片。
4. 判定标准
GRP94主要表达在细胞质内，呈棕黄色颗粒。由于结肠、肾及肝结构不同，选择不同的判断标准：每片随机观察5个视野，按平均每个视野阳性反应面积占所观察的结肠粘膜面积或肾小管面积或肝视野面积的百分比，计：＜30%为“+”，30%～60%为“++”，＞60%为“+++”。
结果
1. 结肠
10～12周：结肠粘膜单层柱状上皮及肠腺上皮细胞质内出现较多的棕黄色颗粒(+/++)，其他部位未见着色(图1)。18～20周：肠腺明显，杯状细胞数量增多。结肠粘膜上皮及肠腺上皮细胞质内棕黄色颗粒明显增多，主要位于细胞的基底部(+++)(图2)。28～31+2周：肠上皮细胞呈现较多的棕黄色颗粒，肠腺上皮细胞表达更为明显(+++)(图3)。
阴性对照：结肠粘膜无棕黄色颗粒出现，为阴性(-)(图4)。
2. 肾皮质
10～12周：阳性颗粒定位于肾小管上皮细胞质内，主要靠近管腔面的胞质内分布，数量较少(+)(图5)。18～20周：肾皮质中可见数量较多的肾小球及已分化的各种肾小管，阳性颗粒存在于肾小管上皮细胞中，以近端小管为主，阳性物质明显增多(+++)(图6)。28～31+2周：肾皮质进一步发育成熟，肾小体丰富，肾小管上皮细胞内仍然出现较多的棕黄色颗粒(+++)(图7)。
阴性对照：肾皮质中无棕黄色颗粒，为阴性(-)(图8)。
3. 肝
10～12周：靠近中央静脉处的一些肝细胞内出现棕黄色颗粒，核周分布明显。颗粒数量较少(+)(图9)。18～20周：肝细胞的胞质内，尤其是核周区呈现较多的棕黄色颗粒，肝小叶内带的肝细胞阳性细胞多于中、外带的肝细胞(++)(图10)。28～31+2周：阳性颗粒明显增加，肝小叶内带的肝细胞表达高于中、外带的肝细胞(++/+++)(图11)。
阴性对照：肝细胞中无棕黄色颗粒(-)(图12)。
4. 胃
(胃体部，20周)：胃粘膜上皮及腺体上皮细胞质内有棕黄色物质，表达量较多(++)，其他部位未见阳性颗粒。
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