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金属硫蛋白与心肌血管内皮细胞的特异结合 |
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由于MT分子较小，不能直接用胶体金标记，需预先将MT与分子量较大的非特异蛋白BSA偶联。本实验按Carlsson方法［7］，用异型双功能交联剂SPDP对MT与BSA进行分子间偶联。偶联后纯化。经检测，BSA与MT摩尔比为1∶2。再按Ackerman方法［8］用同型双功能交联剂戊二醛交联BSA与MT作为方法学对照。纯化后检测BSA与MT摩尔比为1∶1，再按此法交联胰岛素与BSA。
5. 胶体金标记
按Horisberger等［9］方法用15nm胶体金颗粒标记MT与BSA交联物MT-BSA，胰岛素-BSA及BSA，形成MT-BSA，胰岛素-BSA及BSA。并用免疫斑点印迹方法证明标记成功。
6. 离体大鼠心脏灌流
用乌拉坦腹腔注射麻醉后，开胸将大鼠心脏取出，悬于Longendorff装置上。以37℃，95%O2-5%CO2平衡的Krebs-Henseleit(K-H)液行主动脉逆行灌流，灌流压控制在90cmH2O。
7. 实验分组
心脏用95%O2-5%CO2平衡的K-H液预灌流10min后，随机分为以下5组，每组4～5只心脏。
7.1 实验组：将SPDP偶联的MT-BSA及戊二醛偶联的MT-BSA分别加入K-H灌流液进行心脏灌流30min。
7.2 阳性对照组：将胰岛素-BSA加入灌流液并灌流30min。
7.3 阴性对照组：将BSA加入灌流液，灌流30min。
7.4 特异结合部位封闭组：用10倍于MT-BSA中MT浓度的未标记MT预灌流30min，再用MT-BSA灌流30min。
7.5 非特异结合部位封闭组：用大剂量BSA预灌流30min后，再用MT-BSA灌流30min。
上述灌流结束后，用K-H液再灌流10min。切取左心室近心尖部，常规制备电镜超薄切片标本。LKB-4型超薄切片机切片，铅盐与铀盐双染后，透射电镜观察。
结果
在实验组心脏，可见心肌小血管及毛细血管内皮细胞表面有金颗粒附着(图1)。灌流SPDP偶联的MT-BSA，内皮细胞表面附着的金颗粒数量更多些。金颗粒多散在分布，也有三、五成簇地存在于细胞表面。有些金颗粒正被摄入；还有些已被包裹在内皮细胞的吞饮泡内(图1，2，5)。在阳性对照组心脏，也可见到金颗粒附着在内皮细胞表面，这是胰岛素与内皮细胞表面相应受体的特异结合(图2)。然而，在阴性对照组心脏，偶见金颗粒在内皮细胞表面附着(图3)。用较大剂量MT预灌流，再灌以MT-BSA的心脏，内皮细胞附着的金颗粒同样稀少(图4)。但是若预先用较大剂量BSA灌流，再用MT-BSA灌流30min，则在细胞表面能见到与实验组同样多的金颗粒(图5)。
讨论
1. SPDP为异型双功能交联剂，根据加入被偶联蛋白的数量可得不同摩尔比例的两种蛋白偶联物。在本实验中，用SPDP偶联的MT-BSA中MT与BSA的摩尔比为2∶1。用戊二醛偶联的MT-BSA中MT与BSA摩尔比为1∶1。电镜下可见用SPDA偶联的MT-BSA灌流心脏，其中血管内皮细胞表面附着的金颗粒较多，而用戊二醛偶联的MT-BSA灌流后金颗粒较少。这表明本实验方法的可靠性。用MT-BSA灌流后血管内皮细胞表面有多量金颗粒附着，而用BSA灌注后几乎未见金颗粒，说明内皮细胞对MT-BSA的结合与MT有关。如果预先用较大量MT灌流后再灌流MT-BSA，则未见金颗粒；但是较大剂量BSA的预灌流却不起封闭作用，说明MT与内皮细胞结合是特异的。本实验还选用了内皮细胞上已知存在受体、分子量与MT相近的胰岛素作为实验的方法学对照，以同样的方法偶联、标记(胰岛素-BSA)，用胰岛素-BSA灌注心脏后的阳性结果(细胞表面有多量金颗粒)与MT-BSA灌注心脏后的阳性结果是一致的，进一步说明本实验所采用方法的可靠性。提示内皮细胞表面可能存在MT特异结合位点。最近已有研究表明在脑星形胶质细胞上也可能存在MT特异结合位点［10］。
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