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抑制性底物杂交 SSH 技术研究BXSB小鼠的差异表达基因 |
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统性红斑狼疮是一种多基因异常所致的遗传病［3］。我们以BXSB小鼠骨髓细胞为Tester,以 C57-BL-6小鼠骨髓细胞为Driver,利用抑制性底物杂交(Suppression subtractive hybridization,SSH)技术［4］，探讨SLE发病相关基因。
1 材料与方法
1.1 动物 BXSB雄鼠购自美国Jackson实验室，由免疫系动物室饲养。C57-BL-6雄鼠，由北京医科大学实验动物部提供。
1.2 细胞制备 取4周龄BXSB和C57-BL-6雄鼠，同时断颈处死，分别无菌取其骨髓，用pH7.2 Tris.NH4Cl溶解红细胞，制备骨髓细胞悬液，计数细胞，调整Tester、Driver细胞数一致，达到1×107ml-1。
1.3 细胞RNA的提取
1.3.1 总RNA的提取 采用GIBCO BRL公司的TRIzolTM 试剂，所用操作按试剂说明书进行。提取的总RNA溶于无RNase的水中，分光光度计(Backmen 640)定量后，用于点杂交。
1.3.2 细胞mRNA的提取 采用Pharmacia公司的Quick Prep Micro mRNA Purification kit，操作按试剂盒说明进行。提取的mRNA用于合成双链cDNA。
1.4 合成双链cDNA 采用Clontech公司的PCR-SelectTM cDNA Subtraction kit中的试剂和酶，按说明书操作。模板为上述Driver和Tester的mRNA。
1.5 SSH差异筛选 采用Clontech公司的PCR-SelectTM cDNA Subtraction kit。原理详见参考文献［4］。操作按说明书进行。将扩增产物经处理后连接到pGEM-T Easy载体中，转化XLI-Blue菌，筛选阳性克隆，用PEG沉淀的方法纯化质粒DNA，由皓嘉国际公司代为测序。
1.6 在GenBank中进行序列比较并登记新基因 将测序所得到的序列通过E-mail或http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov进行同源性比较，通过GenBank中的www.ncbi.nlm.nih.gov的Bankit功能进行新基因登记。
1.7 mRNA斑点杂交 将序列分析后显示可能与系统性红斑狼疮有关的基因的cDNA制成标记探针(采用Dupont NEN NEL 803试剂盒)；用Tester和Driver的总RNA进行点杂交分析，尼龙膜为Dupont产品，具体方法参照说明书和分子克隆［5］。
2 结果
2.1 SSH结果 如图1所示：可见随着杂交过程的进行，Tester和Driver中共同条带大部分消失，部分条带加强，这些可能是Tester特异表达或高表达的基因。
图1 利用SSH技术研究BXSB小鼠差异表达基因片段的电泳结果
Fig.1 Electrophoretic analysis of result of study on differential expressed gene fragments of BXSB mouse using SSH technique
Note：1.DNA molecular weight marker；2.PCR amplification products after cDNA of BXSB mouse was ligated with adapter-1 and adapter-2；3.PCR amplification products after SSH hybridization
2.2 测序和同源性比较结果 将所得序列通过E-mail或www.ncbi.nlm.nih.gov进行同源性分析，结果如表1。
表1 利用SSH技术研究BXSB小鼠差异表达基因
Tab.1 Differential expressed genes of BXSB mouse studied by SSH method
Clone Length of
DNA
fragment Homogenecity
(%) Homogeneous sequence Result of
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