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转基因小鼠肝癌细胞株的建立及生物学特性研究 |
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a;细胞，以pLXSN作空白转染，按文献［3］进行病毒滴度的测定。
1.3 转基因小鼠肝癌细胞H22-mIFN-γ的建立 用PA317-mIFN-γ细胞病毒上清(病毒滴度为2×105 CFU/ml)感染H22细胞，G418筛选，得到H22-mIFN-γ细胞。空白载体病毒上清作对照(得H22-LXSN)。
1.4 细胞形态的观察和生长曲线的测定 取对数生长期H22、H22-LXSN、H22-mIFN-γ细胞，用光学显微镜、透射电镜、扫描电镜对其外部形态和内部结构进行了观察并对细胞的生长曲线进行了测定［4］。
1.5 细胞DNA含量和细胞周期的测定 用流式细胞仪测定细胞各期DNA的含量。
1.6 γ-干扰素生物活性的测定 按文献［5］进行。
1.7 间接荧光法测定H-2 II类抗原的表达 用大鼠抗小鼠H-2 Ia单抗作为一抗，FITC标记的兔抗大鼠免疫球蛋白为二抗，用流式细胞仪进行测定。
1.8 细胞致瘤性的测定 按文献［4］进行。
2 结果
2.1 转基因小鼠肝癌细胞H22-mIFN-γ的建立 用病毒上清感染H22细胞，经G418筛选得到阳性克隆，感染率为50％～70％。用PCR方法检测转基因细胞中mIFN-γ (465bp)和选择标记基因NeoR (790bp)的存在，结果证实了mIFN-γ基因的转入(图1)。
图1 基因修饰前后H22细胞基因组DNA的PCR检测
Fig.1 PCR analysis of H22 cell modified by mIFN-γ gene
Note:M. 100 bp DNA ladder marker；1,2,3. H22, H22-LXSN,H22-mIFN-γ + mIFN-γ/NeoR primer
2.2 细胞形态和生长情况的观察 从光镜和电镜的观察结果来看，转基因前后细胞的外部形态和内部结构均无明显变化，细胞的生长曲线也比较一致(图2)。
图2 细胞生长曲线
Fig.2 The growth curve of cell
2.3 细胞DNA含量和细胞周期的测定 经测定，细胞DNA含量和细胞周期无明显改变(表1)。
图3 mIFN-γ基因修饰前后肿瘤细胞在动物体内的生长曲线
Fig.3 The growth curve of mIFN-γ gene modified tumor cell in experimental animals
2.4 γ-干扰素生物活性的测定 经测定，细胞培养上清中有一定活性的γ-干扰素分泌，在6～48 U之间，连续传代发现该细胞能持续分泌一段时间，各克隆间有一定的差异(数据未列出)。
2.5 MHC II类抗原的表达测定 在H22-mIFN-γ细胞中，部分克隆的表达量有明显增加，其细胞阳性率和阳性峰平均倒数均有不同程度的增加，但在部分克隆中没有观察到表达量增加的现象(表2)。
2.6 转基因细胞的体内致瘤性结果 从图3中可以看出，转γ-干扰素基因细胞组动物肿瘤潜伏期延长，肿瘤生长缓慢，另外，动物的成活期明显延长。
表1 细胞周期测定结果
Tab.1 The determination result of cell cycle
Cell G1/G0 S G2+M
H22 16.5 63.5 20.0
H22-LXSN 21.0 61.0 17.0
H22-mIFN-γ 10.4 71.2 18.4
表2 基因修饰前后H22细胞H-2 II类抗原表达的测定结果
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