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多抗甲素与IL |
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A (PAA) Bone marrow transplantation (BMT) Immunoconstitution
骨髓移植后免疫功能的自然恢复是一个相当缓慢而复杂的过程。由于骨髓和胸腺微环境的损伤, GVHD的影响, 加上重建早期T抑制细胞功能亢进, 使BMT后患者免疫机能长期缺损,特别是T细胞功能缺损, 患者常因严重感染而死亡。因此促进BMT后免疫功能的重建是一个重要的研究课题。
近年来随着重组细胞因子及一些药物的出现,为研究BMT后免疫功能重建开辟了新的领域, 并已展示出广阔的应用前景。已有报道IL-2能明显促进BMT后免疫功能的恢复。多抗甲素(PAA)是一种很有效的造血刺激剂, 具有明显的免疫增强作用和促进骨髓造血的功能。本文通过体内实验报道了PAA与IL-2单独及协同对BMT小鼠免疫重建的促进作用, 并对其作用机理进行了初步探讨。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 动物 Balb/c (H-2d), C57BL/6 (H-2b) 纯系小鼠, 10～14 周龄,雌雄皆有，北京医科大学动物部提供。
1.1.2 试剂及细胞株 刀豆蛋白A (ConA),细菌脂多糖(LPS), 丝裂霉素C 为Sigma公司产品。3H-TdR，中国科学院原子能研究所产品；Ly2-FITC，L3T4-PE，BD 公司产品；rhIL-2，北医免疫系马大龙教授提供。多抗甲素(PAA)系北京第三制药厂生产的10 ml×10 mg 口服液。
1.2 方法
1.2.1 PAA剂量试验 Balb/c小鼠20只, 随机分成4组, 腹腔注射PAA剂量分别为: 1 组12.5 mg/(kg.d), 2组25.0 mg/(kg.d), 3组50.0 mg/(kg.d), 4组100.0 mg/(kg.d)。 连续用药7 d, 同时另设正常对照组, 用生理盐水代药, 处理同上。第8 天小鼠断颈处死, 取脾细胞制悬液, 测定PFC/脾值。
1.2.2 骨髓移植 Balb/c小鼠脱颈处死后, 无菌取股骨和胫骨, 用RPMI 1640冲洗骨髓腔,过4号针头制成单个骨髓细胞悬液。 另取Balb/c小鼠40只,经60Co源750 Rad照射( 剂量率约90 Rad/min)后, 4 h内经尾静脉输入2×107个供体骨髓细胞,然后分组将小鼠置无菌饲养笼内饲养［1］。从第2天开始给药, 连续7 d, 至BMT 后30 d测定免疫功能,密切观察动物的状态。
1.2.3 细胞对丝裂原的增殖反应 取经照射的Balb/c小鼠进行随机分组, 第1组为BMT后生理盐水对照, 第2组为BMT后应用PAA实验组。 第3组为BMT后应用IL-2实验组, 第4组为BMT后应用PAA+IL-2实验组。 于BMT后30 d测定小鼠脾细胞对ConA、LPS的增殖反应,具体方法详见文献［2］。
1.2.4 溶血空斑实验(PFC) 分组同第4组, 方法为Cunningham小室法［3］；混合淋巴细胞反应(MLR)，分组同第4组, 方法见文献［4］；对异型小鼠脾细胞的迟发型超敏反应(DTH)，分组同第4组, 方法见文献［5］；白细胞介素2(IL-2)诱生，分组同第4组, 方法见文献［6］。
1.2.5 共同培养实验 处死骨髓移植小鼠无菌取脾制备单个细胞悬液, 用10%RPMI 1640液配成 2.5×106 ml或5.0×106 ml于正常Balb/c小鼠脾细胞悬液混合培养。检测对ConA 增殖反应及IL-2的产生。
1.2.6 T细胞表型分析 断颈处死小鼠, 然后取小鼠脾脏,制成单个脾细胞悬液。并经NH4Cl-Tris 去除红细胞, RPMI 1640洗2次, 计数并配成1×107ml-1, 取0.1 ml(含1×106个细胞)加入Eppendorff管中, 加FITC-抗LY2和PE-抗 L3T4 50μl, 在4℃,30min进行双荧光染色, 然后用1%NaN3-5%NCS-Hank s液洗2～3次,重悬于1 ml 保存液中再过尼龙膜去除细胞团, 作流式细胞分析(FACS)。
1.2.7 统计学处理 采用t检验。
2 结果
Balb/c小鼠连续腹腔注射PAA 7d, 各剂量用药组小鼠脾细胞对SRBC的IgM PFC数较正常未用药鼠增强, 且以50 mg/(kg.d)剂量下最为显著 ,故以后实验PAA用药剂量均定为50 mg/(kg.d)。BMT小鼠从移植后上一页 [1] [2] [3] 下一页
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