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丙肝病毒 HCV 基因免疫实验研究 |
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immunization can aid the development of HCV vaccines.The pcDNA-HCV might be promising candidates as antiviral agents.
Key words Hepatitis C virus DNA-based immunization Gene immunization
目前HCV疫苗研究受两大因素制约，首先，HCV体外细胞培养系统尚未建立；其次，HCV至少有6个基因型，而且HCV膜蛋白区具有高度的变异性，易发生免疫逃逸和耐受，采用传统研究方法很难获得对不同HCV株型具有交叉免疫功效的疫苗［1］。基因免疫，亦称核酸疫苗，既可诱导体液免疫应答，也可诱导细胞免疫应答，这种特异性的细胞免疫应答不仅对预防不同株型的HCV感染具有重要意义，而且对慢性病毒感染可能具有治疗作用［1-3］，本文对HCV高度保守的核心区基因免疫进行了实验研究。
1 材料与方法
1.1 质粒DNA的构建 从含Ⅱ型HCV核心区基因片段的质粒pTZ19经EcoRI及XbaI双酶切，电泳回收392 bp的含有ATG和TAG的HCV核心区基因片段(cDNA),定向克隆于已预先用EcoRI及 XbaI双酶消化好的真核表达载体pcDNA3(Invitrogene CO.USA)的CMV启动子下游，经氯化钙转化大肠杆菌JM109(北医马大龙教授惠赠)，经LB培养基扩增，按碱裂解法提取质粒，经紫外分光光度计测定浓度，按1 μg/μl溶于无菌PBS，-20℃保存备用。
1.2 免疫接种 选用4～6周龄的Balb/c小鼠，用1 ml的OT注射器(25号针头)行双后肢多点肌肉注射及尾部多点皮下注射，肌肉注射深度严格控制在0.2 cm±。每只小鼠注射总量100 μg，为加强免疫，2 w后追加免疫1次。实验中设对照组，注射等量空白质粒pcDNA3。
1.3 血清收集及抗HCV抗体检测 采用割尾或眼眶静脉丛穿刺连续采血，每次采血量0.3～0.5 ml，离心收集上清置-20℃冰箱，一次性检测。用酶联免疫试验(ELISA)检测血清抗-HCV抗体，试剂盒购自北京生物制品研究所，二抗为羊抗鼠IgG，按试剂盒说明进行检测。
1.4 T细胞抗原特异性增殖反应测定 通过摘眼球放血处死肌肉免疫组小鼠，制备小鼠脾细胞悬液，细胞浓度为1×106ml-1，加入96孔板，每孔100μl，平行3孔，分别加入HCV核心抗原(HCVcAg)5 μg/孔，37℃、5%CO2，孵育72 h，加MTT10μl、37℃、6h，再加盐酸异丙醇100μl/孔，混匀，静置15 min，测各孔A570值，计算增殖指数。增殖指数=实验组OD值/对照组OD值［4］ 。
2 结果
2.1 pcDNA-HCV质粒的鉴定 pcDNA-HCV经EcoRI和XbaI双酶切后，电泳可见392 bp(见图1)的条带，而空载质粒 pcDNA3则无此条带，证明HCVcore基因已被插入pcDNA-HCV。
图1 pcDNA-HCV，ptz19的限制性内切酶图谱分析
Fig.1 Restriction analysis of pcDNA-HCV,ptz19
Note:1.DNA standard:PBR322DNA/BstNI;2.pcDNA3 cut by EcoRI/XbaI;3.pcDNA-HCV cut by EcoRI/XbaI;4.ptz19 cut by EcoRI/XbaI
2.2 血清抗-HCV抗体检测结果 5只经皮下注射的免疫鼠中有4只出现抗-HCV抗体，5只经肌肉注射的免疫鼠全部出现抗体阳转，而对照组全阴性，抗体水平及动态改变见图2、3，同样肌肉免疫注射组高于皮下注射组，加强免疫后2 w出现抗-HCV，4～8 w达高峰，可持续12 w以上。而注射空载质粒的对照组无1只抗-HCV抗体阳性。
图2 基因免疫小鼠血清抗-HCV抗体水平
Fig.2 Comparison of antibody response in mice immunized using different methods
Note：1～5 means the codes of the mice
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