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小鼠腹水IgM型单抗的纯化 |
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c小鼠，得到2株抗IL-8单抗SI96、SI97。用亚型快速鉴定条（ARGENE Biosoft, France）鉴定均为IgM亚类。制备和收集腹水，加入CaCl2(终浓度至25 mmol/L)，室温静置30 min，离心去除纤维蛋白。-20℃冻存备用。
1.3 IgM的纯化 硫酸铵沉淀法：腹水于4°C滴加硫酸铵至45%浓度，5 min后离心收集沉淀。用4倍原体积的PBS溶解。将此样品立即进行凝胶过滤或-20℃冻存。
优球蛋白沉淀法：按Garcia-Gonzalez M 等所述［3］，将腹水在4°C蒸馏水中透析8～15 h，12 000 r/min离心15 min，收集沉淀蛋白，重新溶解于1 mol/L NaCl/0.1 mol/L Tris-HCl pH8.0的缓冲液中，立即进行凝胶过滤或-20℃冻存。凝胶过滤：先用10 mmol/L Tris-HCl pH8.0缓冲液平衡SuperdexTM-200 prepgrade 预装柱，将硫酸铵沉淀或优球蛋白沉淀收集的1 ml样品上样,用1.5 mol/L NaCl/10 mmol/L Tris-HCl pH8.0的缓冲液进行洗脱，洗脱流速控制在1～2 ml/min。收集的洗脱峰分装冻至-20℃。
1.4 蛋白质定量和电泳 蛋白质定量采用改良Bradford法［6］。以15%还原性SDS-PAGE检测样品纯度［4］。
1.5 IgM活性测定 采用间接ELISA法，以0.1ml 2μg/ml的HPLC纯rhIL-8抗原包板，4℃过夜，次日以5%BSA-PBS pH7.4, 37℃封闭2h; 加入待测的IgM型抗人IL-8单抗, 37℃反应2 h后加入ALP-羊抗小鼠免疫球蛋白多抗,37℃反应2 h。最后加底物显色。以WS-4为标准抗体，计算IgM抗体量。
2 结果
2.1 IgM的纯化、纯度鉴定以及分子量测定 腹水IgM抗体SI96、SI97经球蛋白沉淀后，用SDS-PAGE分析，结果表明用球蛋白沉淀纯化不同来源的抗体,IgM纯度在40%～60%之间，见图1。SI97腹水用45％硫酸铵沉淀后凝胶过滤分离，IgM洗脱峰在110 min出现(图2)，所得IgM抗体纯度<60％。SI97腹水用优球蛋白沉淀后凝胶过滤，IgM洗脱峰于100 min时出现(图3)，纯度>90%。SDS-PAGE可见2条蛋白区带，分别位于分子量约25 kD和70 kD的位置，显示此抗体蛋白由大、小2个亚单位组成(图4)。
图1 球蛋白沉淀法纯化的IgM抗体电泳图
Fig.1 Euglobin precipitation of mouse IgM MAbs analyzed by reducing SDS-PAGE(15% acrylamide)
Note:lane 1：purified SI96 MAbs from ascites fluid by euglobulin precipitation(15 ml)；lane 2：purified SI97 MAbs from asciates fluid by euglobulin precipitation(15 ml)；lane 3：standard protein marker(30 ml)
图2 硫酸铵沉淀后凝胶过滤层析图
Fig.2 Elution profiles obtained after chromatography of ammonium sulfate precipitated ascites fluid on gel filtration
图3 优球蛋白沉淀后的凝胶过滤层析图
Fig.3 Elution profiles obtained after chromatography of euglobulin precipitated ascites fluid on gel filtration
图4 SI97抗体各个纯化过程所得样品的SDS-PAGE图
Fig.4 The pooled fractions from each step in the SI97 MAbs purification analyzed by reducing SDS-PAGE(15% acrylamide)
Note:lane 1: ascites 上一页 [1] [2] [3] 下一页
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