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肝素诱导结晶紫比色法检测成纤维细胞生长因子的生物活性 |
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溶解，于540 nm读吸光度 A值。
2 结果
结果如图1所示。
图1 3T3细胞增殖反应曲线
Fig.1 Proliferation of 3T3 cell line
Note:Half-maximal of A value was stimulated by 24 pg/ml with heparin,by 156 pg/ml without heparin
3 讨论
FGF又分为 aFGF（酸性）和 bFGF（碱性）两种，两者具有相同的生物学功能。其中 bFGF对其受体的亲和性大于 aFGF，因此 bFGF的生物学活性比 aFGF强10～100倍左右［3］。但无论aFGF还是 bFGF都同样能与肝素结合，从而加强了 FGF的生物学功能，在分离纯化 FGF时就利用了这一点，从而大大提高了分离的效果和速度［4］。在本研究中，我们在生物活性的鉴定上也利用这一点来提高其检测的灵敏度。如上图所示，不加肝素诱导的最大吸光度 A值一半为 0.16，所对应的浓度为156 pg/ml，加肝素诱导最大 A值的一半为 0.315，所对应的浓度为24 pg/ml，在aFGF的生物活性检测中加入肝素其灵敏度明显提高。据报道，肝素的存在可使 aFGF的活性增加10～100倍，包括刺激 3T3细胞和血管内皮细胞的生长，其作用的有效浓度范围为10～100 ng/ml［5］。由于 bFGF的活性比 aFGF高，其作用的有效浓度可能会适当降低。
我们利用肝素作为诱导剂，不但提高了检测的灵敏度，而且还缩短和简化了检测的时间和步骤。因为灵敏度高，分辨率也相应提高，省略了无血清或低血清培养 3T3细胞的步骤，直接用细胞培养用血清浓度即可，细胞不用“饥锇”，保持着良好的状态，给后面的检测工作提供了良好的基础。
结晶紫法检测细胞因子生物活性属比色法范畴，它是利用结晶紫的甲醇溶液对活细胞直接进行固定染色，再用水充分洗去剩余的染色液，烘干后用 SDS溶解细胞即可比色。此法操作简便，需时短，无需细胞代谢摄入的中间过程。对于象 3T3这样的贴壁细胞尤其合适，因为染色后的细胞仍然紧贴板壁，只要沿板边小心冲洗掉多余的染料即可，省去了收集和离心洗涤细胞的麻烦。在检测另一种类似的细胞因子即表皮生长因子(EGF)时，我们也运用了结晶紫法，而且还和 MTT和 3H -TdR方法进行实验对照，结果结晶紫法的灵敏度与 3H-TdR法相仿，比 MTT法高［6］。
运用结晶紫法检测 FGF的生物活性，无论从操作的繁简，经济因素以及对人体和环境的危害等都比现时普遍应用的 3H-TdR法具有优势，加肝素诱导后，灵敏度也相应提高了，这就为结晶紫法的普遍应用提供了前提。
作者简介：叶春婷，女，30岁，硕士，主要从事组织工程学；
李斯明，男，37岁，副主任医师
作者单位：广州市红十字会医院创伤外科研究所，广州 510220
4 参考文献
1 McGee G S.Recombinant basic fibroblast growth factor accelerates wound healing.J Surg Res,1988;45:145
2 Gospodarowicz D.Molecular and biological characterization of fibroblast growth factor： a cangiogenic factor which also controls the proliferation and differentiation of mesoderm and neurectoderm derived cells.Cell Differ,1986;19:1
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