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人肿瘤浸润性树突状细胞的表型分析及原因探讨 |
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免疫逃逸的机制。本文通过对5例胃癌、9例结直肠癌肿瘤组织中浸润性细胞的研究，证实了肿瘤浸润性树突状细胞（Tumor infiltrating dendritic cell ,TIDC）的存在，并通过流式细胞仪检测TIDC的表型，且用RT-PCR的方法检测IL-10、VEGF及TGF-β1在14例肿瘤细胞中的表达。本结果提示肿瘤细胞局部产生的免疫抑制因子IL-10、VEGF及TGF-β1可能是导致TIDC无功能或功能低下的原因之一。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 标本来源 胃癌标本5例,大肠癌标本9例,病理证实均为腺癌,其中直肠癌5例,结肠癌4例,标本均取自上海长征医院普外科。获瘤体重量4.40～8.10g，平均6.03g。患者年龄45～71岁，平均57.5岁，男8例，女6例。
1.1.2 主要试剂 胶原酶IV型，DNA酶I型，透明质酸酶V型，均为Sigma公司产品；淋巴细胞分离液（Histopaque，1.077g/ml）购自Sigma公司;FITC标记的抗人CD1a、抗人HLA-DR单克隆抗体、PE标记的抗人CD86、抗人CD80单克隆抗体、抗人CD54、抗人CD14单克隆抗体、同亚型对照抗体及FITC标记兔抗鼠IgG荧光二抗均购自PharMingen公司。完全培养基包括：RPMI1640，10％小牛血清，2mmol/L谷氨酰胺，0.01mmol/L丙酮酸钠，0.05 mmol/L 2-巯基乙醇，20mmol/L Hepes，1 000U/ml青霉素，链霉素1 000μg/ml,甲硝唑5μg/ml。
1.2 方法
1.2.1 取材 标本切下后，纵向打开肠腔，0.05％洗必泰反复冲洗，切取1/3～1/2肿瘤组织，置于培养皿中称量。然后肿瘤组织块浸于含青霉素1 000U/ml、链霉素1 000μg/ml、甲硝唑5 μg/ml的RPMI1640中30min。
1.2.2 单细胞悬液的制备 将瘤体剪成1 mm3大小，置于含0.05%胶原酶、0.02%DNA酶、0.01%透明质酸酶、10%小牛血清的RPMI1640培养基中，4℃磁力搅拌过夜消化，再经200目钢网过滤，收集所有单细胞悬液，经Hank液洗2遍，调整细胞浓度至1×106 ml-1左右。
1.2.3 细胞分离及流式细胞仪分析 向离心管中依次加入比重为1.077 g/ml和1.055 g/ml的淋巴细胞分离液各2 ml，再在上面加入2～3 ml单细胞悬液，400 g离心20 min，收集处于上层界面的肿瘤细胞，Hank液洗，－70℃冻存；收集2层淋巴细胞分离液界面上的细胞悬液，Hank液洗，置于含10%小牛血清的RPMI1640培养液中，5%CO2 37℃过夜培养。收集悬浮细胞，用FACS标记液PBA（PBS＋1%BSA＋0.02%叠氮钠）调整细胞浓度为5×106 ml-1，加入离心管，100 μl/管，分别按直接标记法或间接标记法进行标记，流式细胞仪（FACS calibur,B.D.公司）检测细胞表面表型。
1.2.4 肿瘤细胞表达免疫抑制因子的RT-PCR检测 取分离冻存的肿瘤细胞，以TRIZOL提总RNA，用AMV作反转录，引物为oligo-dT15，反转录产物作为PCR的模板分别检测VEGF、IL-10及TGF-β1的表达。引物序列分别为IL-10：上游5 ACAGCTCAGCACTGCTCTG，下游5 AGTTCACATGCGCCTTG；VEGF：上游5 TTGCTGCTCACCTCCAC，下游5 AATGCTTCTCCGCTCTG；TGF-β1：上游5 CCCTGGACACCAACTATTG，下游5 GTTGGCATGGTAGCCCT。PCR反应条件均为95℃，15 s；55℃，30 s；72℃，30 s；35个循环。同法作正常胃、结肠、直肠粘膜组织中免疫抑制因子的表达。
2 结果
2.1 TIDC的表型分析 对5例胃癌、4例结肠癌、5例直肠癌肿瘤组织中所分离的浸润性淋巴细胞群的FACS分析结果表明，10例有CD1a+、CD86＋表达的细胞存在（见表1），占分离的淋巴细胞数的4.62%±2.89%，细胞活力>80%，且该群细胞除有4例低表达HLA-DR外均不表达HLA-DR，CD54和CD80的表达率也很低，且都不表达CD14（见表1）。
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