|
小檗碱对淋巴细胞与血管内皮细胞粘附及粘附分子的影响 |
| |
GMA)，淋巴细胞分层液(天津中国医学科学院血液病研究所)，鼠抗人ICAM-1单克隆抗体(美国 ZYMED)，鼠抗人CD18单克隆抗体、重组IL-1、重组TNF 、APAAP试剂盒(邦定生物医学公司)。
1.2 实验方法
1.2.1 人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的培养与鉴定［1］ 以0.1%胶原酶消化法分离内皮细胞，用完全M199（含20％FCS，20 μg/ml ECGF）接种细胞于培养瓶(预先用1%明胶包被)，置37℃ 5%CO2孵箱培养，当细胞融合成单层时，以0.125％胰酶-0.02%EDTA消化传代，实验用第3～5代。用第Ⅷ因子相关抗原检测(SP免疫细胞化学染色法)阳性鉴定内皮细胞。
1.2.2 制备人外周血淋巴细胞 常规分离出单个核细胞层，用RPMI1640培养，37℃ 5%CO2孵育48 h供用。
1.2.3 淋巴细胞与内皮细胞粘附实验［2］ 用药物处理呈单层的内皮细胞或淋巴细胞20 h后进行细胞粘附实验，每组3复孔。内皮细胞中加入淋巴细胞3×105～5×105个细胞/孔，37℃ 5%CO2孵育1 h，用PBS洗去未粘附细胞，加入0.25%虎红，100 μl/孔，室温作用10 min，洗去游离虎红，加PBS-乙醇(1:1)200 μl/孔，室温作用1 h后，酶标仪570 nm测A值。最后用实验孔A值减去空白孔(未加淋巴细胞)A值表示粘附量。①小檗碱处理内皮细胞或淋巴细胞后进行粘附实验；②小檗碱加IL-1处理内皮细胞或淋巴细胞后进行粘附实验；③小檗碱加TNF处理内皮细胞或淋巴细胞后进行粘附实验。
1.2.4 内皮细胞表面ICAM-1表达的检测［3］ 用细胞ELISA法，经上述药物处理内皮细胞 20 h后，PBS洗2遍，进行细胞ELISA实验：用4％多聚甲醛于4℃固定40 min后，以2％BSA-PBS 200 μl/孔封闭40 min，然后加入鼠抗人ICAM-1单抗50 μl/孔（用0.1%BSA-PBS稀释 1：200），37℃孵育1 h后加入酶标羊抗鼠IgG抗体100 μl/孔（1：2 000稀释），37℃孵育1 h后加入邻苯二胺底物液200 μl/孔，室温避光15 min，2 mol/L H2SO4 50 μl/孔中止反应，酶标仪492 nm测A值。每步都用0.05％Tween20-PBS洗板3次。
1.2.5 淋巴细胞CD18表达的检测 用APAAP法。用不同药物处理淋巴细胞20 h后，用离心涂片机制备细胞涂片（每组3张片），用APAAP法检测。 显微镜下计数200个淋巴细胞，计算阳性细胞百分率。
1.3 统计学处理 t检验。
2 结果
2.1 小檗碱对淋巴细胞与内皮细胞间粘附的影响 表1结果表明，小檗碱处理内皮细胞后，可抑制其与淋巴细胞间的粘附，与对照组比较有明显差异，且有剂量依赖趋势；小檗碱处理淋巴细胞后，对其与内皮细胞的粘附无明显作用。
表1 小檗碱对淋巴细胞与内皮细胞间粘附的影响
Tab.1 Effect of berberine on lymphocyte-endothelium adhesion
Group Dose EC-LC adhesion LC-EC adhesion
(μg/ml) A value(±s) A value(±s)
(pretreat EC) (pretreat LC)
Control 0.039 7±0.006 4 0.069 7±0.005 9
Berberine 0.32 0.027 3±0.003 81) 0.065 3±0.012 9
1.60 0.020 3±0.004 51) 0.061 3±0.009 6
8.00 0.014 0±0.004 62) 0.063 3±0.004 5
上一页 [1] [2]
上一个医学论文： 血小板活化因子抗体的研制
下一个医学论文： 肿瘤标记物CA125测定及其临床意义
|
|
|
|
|
|
|
您现在的位置： 绿色健康网 >> 医学论文 >> 基础医学论文 >> 正文