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咖啡因对胎鼠及乳鼠睾丸生殖细胞DNA合成影响的体外研究 |
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数量减少等［2］。Caf在胎儿、新生儿体内代谢较慢，使其在胎儿、新生儿体内蓄积，此时Caf对生殖细胞有无影响?值得研究。有的学者发现，Caf可作用于细胞核，影响到使胞核崩解、染色体断裂［3］。因此我们选择检测了与细胞合成DNA有关的［3H］-TdR标记细胞数、DNA含量等指标来探讨Caf对生殖细胞DNA合成的影响。
材料与方法
一、睾丸组织块培养及组织学样品制备：
1.培养分组：取健康SD大鼠的18 d雄性胎鼠、0 d(出生当天)、4 d雄性乳鼠之睾丸组织，切为 1mm×1mm×1 mm左右的组织块，分别于下列培养液中培养1、2、3周：a.DMEM:对照组；b.DMEM+0.3 mmol/L咖啡因，低浓度组；c.DMEM+0.6 mmol/L咖啡因，中浓度组；d.DMEM+1.2 mmol/L咖啡因，高浓度组。
每一实验组培养组织块的数量不少于10块。4 d乳鼠来源的组织块置于32℃培养箱、18 d胎鼠及0 d新生鼠来源的组织块置于37℃培养箱内培养，两个培养箱内均含湿润的体积分数为5% CO2、95%空气。每隔3 d换培养液。对拟作放射自显影的组织，培养结束前在培养液内加入3.7×104 Bq/mL的［3H］-TdR共同孵育16 h。
2.组织样品制备：培养结束后，组织块用PBS冲洗两次。经［3H］-TdR示踪的组织用10%甲醛固定，未示踪者分别用10%甲醛和FAA(甲醛∶95%酒精∶冰醋酸为10∶85∶5)固定，包埋时将同一实验条件下的5～6块组织置于同一蜡块中。切片厚度为4 μm。
二、HE染色及放射自显影的观察计数：
1.HE染色及生殖细胞数量的记数：常规HE染色，每组选取10个组织块，每个组织块选取10个垂直切面的生精小管(共10×10=100个)，计算小管内生殖细胞数与包括支持细胞在内的全部细胞数的百分比，并将各实验组与对照组相比较。
2.［3H］-TdR放射自显影(autoradiogrophy,ARG)方法及生殖细胞阳性率的计数：［3H］-TdR示踪后的组织切片用浸膜法［4］涂布乳胶，4℃冰箱内曝光10 d，经显影、定影、苏木素复染后，常规制片。ARG的对照片用不经［3H］-TdR示踪的睾丸培养组织切片，同法涂布乳胶，其余步骤同实验片。随机选取50个生殖细胞，黑色银粒平均为3～4个/生殖细胞，定为本底。
生殖细胞摄取［3H］-TdR阳性率的计数方法是：每个实验组选取10个组织块，每个组织块选取10个垂直切面的生精小管(共10×10=100个)，光镜下有5粒以上黑色银粒的生殖细胞即为标记的生殖细胞。检测生精小管内标记的生殖细胞数及生殖细胞总数(包括标记与未标记的生殖细胞)，计算百分比，与对照组作比较。
三、生殖细胞核DNA染色及其DNA含量的三维定量分析：
1.Feulgen染色：切片用二甲苯脱蜡后，5 mol/L HCl室温水解20 min，Schiff试剂(常规配方)室温染色1 h。
2.生殖细胞核DNA含量的三维定量分析：(1)以核距法测量生殖细胞核体积等参数，具体方法参照文献［5］。每组分别从同一切片上的5～6块组织中选取100个以上的的生殖细胞核进行测量。(2)按柯勒照明要求调整Olympus BX50多功能显微镜光源，在物镜与黑白摄像机之间插入535/35 nm的带通滤光片。40倍物镜(NA0.75)下，使用Tiger细胞图像分析仪(其测量光密度的性能参照文献［6］)测量切片上的生殖细胞DNA的二维光密度参数，具体方法参照文献［6］。(3)生殖细胞核DNA含量的三维体积积分光密度：具体方法参照文献［7］。
四、统计学处理：
各Caf浓度实验组分别与同一鼠龄、同一培养时间的对照组比较。计数资料采用卡方检验处理，计量资料采用t检验。
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