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taline; Rats
长期以来，5-羟色胺(5-hydroxytryptamine, 5-HT)与肺动脉高压的关系一直未形成明确的概念，随着研究思路和方法的改进及5-HT受体药理学的发展，现在认为5-HT在肺动脉高压的发生发展中起相当重要的作用。肺动脉和体动脉不同，对5-HT的缩血管效应比对去甲肾上腺素的更敏感。对5-HT在不同原因形成的肺动脉高压中的作用要做具体分析。例如5-HT在肺血栓性肺动脉高压中的作用比在缺氧性肺动脉高压中的作用更为重要［1］。Carillo等报道用5-HT合成抑制剂ρ-chlorophenylalanine可部分阻止野百合碱(monocrotaline,MCT)引起的肺动脉压升高和肺血管阻力增加［2］。Kanai等最近报道在MCT皮下注射后12～72 h动脉血中5-HT含量升高［3］，说明5-HT在MCT性肺动脉高压发生中具有一定作用。但是5-HT在动脉血中升高，为什么只引起肺动脉高压而无体循环高压，为什么5-HT增加只在注射MCT早期，而在肺动脉高压发生时却不增高，这种时相难以吻合的现象如何解释，本实验用免疫组化法做了进一步探讨。
材料与方法
一、动物及分组：
8周龄雄性SD大鼠20只，体重(180±16) g，由第四军医大学实验动物中心提供。随机分为2组，每组10只。对照组背部皮下注射双蒸水3 mL/kg体重；MCT组背部皮下注射2%MCT 3 mL/kg(60 mg/kg体重)。
二、药品：
5-HT抗体和5-HT抗独特型单克隆抗体，由本校组织胚胎学教研室惠赠。5-HT硫酸肌酐，瑞士进口分装，批号：65-02-29，ABC药盒，购自武汉博士德生物制品公司。小牛血清(NBS)，浙江四季青生物制品研究所，批号19951125。MCT，纯度99%，由山西医学院电镜室惠赠。
RPMI 1640培养基，3-(4，5)-二甲基噻唑-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)，二甲基亚砜，EGTA，Triton X-100,均为Sigma公司产品。Fura-2/AM 中国医学科学院药物研究所产品。无钙清洗液：成分：(mmol/L) NaCl 145, KCl 5, MgSO4 1, Glucose 10, Hepes 10, pH 7.40。负载液：成分RPMI 1640培养液含有2 g/L牛血清白蛋白，2 mmol/L谷氨酸，Hepes 10 mmol/L pH7.40。
三、方法：
从各组实验动物的左肺下叶取组织块，中性甲醛固定，常规石蜡包埋，连续切片2张，其中1张组织切片用于5-HT免疫组化染色［4］，另1张用于5-HT受体免疫组化染色［5］，具体方法如下：
(一)肺组织切片5-HT免疫组化染色：肺组织切片→二甲苯脱蜡(10 min)→100%乙醇脱二甲苯(10 min)→0.5% H2O2，80%甲酶(消耗内源性过氧化物酶20 min)→PBS洗2次5 min/次→兔抗5-HT抗体(1∶5000) 24 h，4℃→PBS洗3次，5 min/次→加二抗(生物素标记的羊抗兔1∶200) 1 h，室温→PBS洗3次，5 min/次→ABC复合物(1∶200)30 min室温→显色。
用正常兔血清取代第一抗体孵育作对照实验。
(二)肺组织切片5-HT受体免疫组化染色：将兔抗5-HT抗体换为5-HT抗独特型抗体(1∶100)进行免疫组化染色，其他步骤步与(一)相同。
(三)5-HT及5-HT受体阳性细胞记数及相对含量测定：经5-HT抗体及5-HT抗独特型抗体进行免疫组化染色的肺组织切片用图象分析仪测定阳性细胞的数量及其光密度值，每组随机取5张切片(来自5只大鼠)，每张切片连续测定10个视野(0.0627 mm2/视野)内阳性细胞的数目，测定其中30个阳性细胞的光密度值以表示其相对含量。
(四)5-HT对培养的大鼠肺动脉平滑肌细胞生长及功能的影响：
1.大鼠肺动脉平滑肌细胞培养：雄性SD大鼠，体重100～110 g(第四军医大学实验动物中心提供)，腹腔注射戊巴比妥钠(30 mg/kg体重)麻醉后，无菌操作取出心肺，置于盛有D-Hanks液的培养皿中，分离肺外动脉，按Chamley-Camplell［6］介绍的贴壁法，培养肺动脉平滑肌细胞(pulmonary artery smooth muscle cell, PASMC)，即仔细上一页 [1] [2] [3] 下一页
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