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慢性缺氧对大鼠肺内细胞增殖 凋亡及相关基因表达的影响 |
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以R/L+S表示右心室增厚程度。在弹力纤维染色切片上选择圆形或类圆形小动脉，用图像分析系统分析伴行于小气道(终末细支气管、呼吸性细支气管)的小动脉，计算中膜厚度百分比(中膜厚度×2/血管外径)，表示肺小动脉增厚程度。每例标本选4张切片，每张切片至少计数20个小动脉。
(三)免疫组化分析：
1.凋亡检测：细胞凋亡原位dUTP缺口末端DNA碎片标记试剂盒购自德国Boehringer Mannheim公司。原理为凋亡细胞核内DNA断裂为含3’-OH末端的碎片，通过末端转移酶催化连上荧光标记的脱氧核苷酸，再用过氧化物酶标记的抗荧光抗体作二抗通过底物显色而检出［4］。使用石蜡切片。操作按说明书进行，显色后行苏木素核复染。
2.组化染色：c-myc、bcl-2、Ki-67单抗及SABC试剂盒均购自北京中山公司。前两者选用冰冻切片，后者选用石蜡切片。按常规SABC法进行。
3.阴性对照：凋亡染色加反应混合液进一步混合，液中不含末端转移酶。组化染色用PBS代替一抗。
4.细胞增殖及凋亡比率统计：每例标本取4张切片，每张切片任取5个视野进行细胞计数，每张切片至少计数1千个细胞。增殖指标是以与细胞增殖密切相关的Ki-67抗原染色表示。增殖或凋亡率是以明显的增殖或凋亡阳性染色细胞占同一视野细胞总数的百分比表示。为排除可能由于细胞固定不及时造成的早期细胞自溶形成的DNA断裂而造成的弱阳性着色，凋亡细胞只计数典型深棕色染色者。
(四)Northern杂交：用异硫氰酸-酚-氯仿一步提取法提取组织中总RNA。杂交参照“分子克隆”第二版：加样、电泳、转膜、预杂交后，与［32P］标记的c-myc探针(1.4 kb cDNA片段，EcoRI/ClaI)或bcl-2探针(0.8 kb cDNA片段，BamHI/SacI)杂交，洗膜后自显影，测各杂交带光密度值。再洗去上述探针，重新与β-actin探针杂交，以β-actin杂交量作加样内参照。
结果
一、右心室重量及肺血管壁厚度：
大鼠R/L+S值对照组为0.28±0.02，缺氧1、2周组分别为0.36±0.03和0.39±0.04(P均＜0.05)。肺小动脉壁中膜厚度百分比对照组为4.58%±0.54%，缺氧1、2周组分别为7.67%±0.75%和9.74%±0.81%(P均＜0.05)。
二、细胞增殖与凋亡分析：
三组大鼠肺组织内均检出一定比率的增殖及凋亡细胞。两类细胞在肺内呈散在分布，有些区域相对集中，主要可见于肺血管壁以及肺组织其它部分(图1、2)。增殖率缺氧1、2周组为6.14%±1.78%、6.54%±1.80%，显著高于对照组的3.35%±0.86%，P＜0.01。凋亡率缺氧1、2周组为1.93%±0.62%、1.77%±0.88%，显著少于对照组的3.25%±0.58%，P均＜0.05。增殖/凋亡值缺氧1、2周组分别约为对照组3、3.5倍。
Fig 1 In situ terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling of apoptotic cells in lung of rat exposed to hypoxia for 2 weeks, TUNEL×75
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