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U46619对培养的人气道平滑肌细胞增殖的作用 |
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2 培养基，抗平滑肌α-肌动蛋白均购自Sigma公司。
三、实验方法：
1.人气管平滑肌细胞培养：无菌切下邻近隆突的气管，用Hanks液洗涤3遍，去除上皮，结缔组织、血管、软骨，用虹膜剪将气管平滑肌剪成1～2 mm的小块组织置于培养瓶底部，呈阵状排列。将培养瓶放入孵箱。12 h后组织块贴壁，加入含有20%胎牛血清的F-12培养基。细胞7 d开始生长，14 d达到融合。融合时用0.25%胰蛋白酶和0.04%的EDTA等量混合后消化传代，2～4代的气管平滑肌细胞用于实验。
2.人气管平滑肌细胞鉴定：用抗平滑肌α肌动蛋白单克隆抗体辨认人气管平滑肌细胞。
3.U46619对人气管平滑肌细胞增殖的影响：
(1)细胞计数：第二代人气管平滑肌细胞，以1×107细胞/L的密度接种于培养瓶中，用有血清的F-12培养24 h后，再用无血清的F-12培养24 h，使细胞同步静止于G°期，每3瓶分别加入含有1 nmol/L、10 nmol/L、100 nmol/L的U46619的无血清F-12培养基，另有两组分别加入1 新霉素、100 nmol/L U46619及10 μmol/L消炎痛、100 nmol/L U46619的无血清F-12培养基，对照细胞单独用无血清的F-12培养，48 h后计数细胞。
(2)［3H］-胸腺嘧啶核苷(［3H］-TdR)掺入试验：传代细胞以1×107细胞/L接种于24孔培养板，每孔1 mL。用无血清的F-12培养24 h后，每3孔分别加入含有1 nmol/L、10 nmol/L、100 nmol/L、1 μmol/L的U46619，或者含有1 μmol/L的新霉素、100 nmol/L的U46619，或者含有10 μmol/L的消炎痛，100 nmol/L的U46619的无血清F-12培养基，另外3孔作为对照组单独加入无血清的F-12。24 h后，用37×107Bq/L的［3H］-TdR(Amersham,放射比度1.85 GBq/mol)标记12 h，于终点常规消化，收集细胞、洗涤干燥，测每分钟放射性核素闪烁记数值(counts．min-1)。
4.U46619对Ins(1，4，5)P3累积量的影响：传代细胞以1×104细胞/cm2的密度接种于培养瓶中，用含有20%胎牛血清的F-12培养基孵化1周后，分别加入1 nmol/L、10 nmol/L、100 nmol/L的U466195 min，另外3瓶细胞加入1 μmol/L的新霉素2 h后加入10 nmol/L的U466195 min，还有3瓶作为对照组。细胞被标准化到1×106细胞，用6%的高氯酸溶解，碳酸氢钠中和，保持在冰中1 h，离心(20 000×g，4℃，25 min)，后取出1 000 μL上清液，用放射性配基竟争结合法测定Ins(1，4，5)P3累积量(Amersham)
四、数据表达方式和统计方法：
细胞计数以细胞数/cm2及百分数表达。实验组的百分数＝实验组细胞计数/对照组细胞计数)×100%。［3H］-TdR以counts．min/L及百分数表达。实验组［3H］-TdR的百分数＝(实验组［3H］-TdR/对照组［3H］-TdR)×100%。Ins(1，4，5)P3以pmol/106细胞及百分数表达。实验组Ins(1，4，5)P3的百分数＝［实验组Ins(1，4，5)P3/对照组Ins(1,4,5)P3］×100%。
实验数据以均值±标准差()表示，用ANOVA及Student s test判定差异显著性。
结果
一、U46619对人气管平滑肌细胞增殖的作用：
表1可以看出U46619引起的细胞数的变化在一定范围内(1 nmol/L～100 nmol/L)以浓度依赖的方式增加，以100 nmol/L的U46619引起的细胞数增长的峰值最高。磷脂酶C抑制剂1 μmol/L的新霉素和环氧化酶抑制剂10 μmol/L消炎痛对于100 nmol/L的U46619引起的细胞数增长没有抑制作用。
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