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大鼠皮质N |
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1-phosphonic acid (CPP,Sigma);2-氨基-5-磷基戊酸(2-amino-5-phosphonlanoicacid,AP5),Sigma;人工脑脊液(artificial cerebrospinal fluid, ACSF):120 mmol/L NaCl, 25 mmol/L NaHCO3, 3.3 mmol/L KCl, 2.6 mmol/L CaCl2, 1.4 mmol/L KHPO4, 1.2 MgSO4， 7 H2O,10 mmol/L glucose, pH7.4, 自配。
二、实验动物分组及脑损伤模型复制：
雄性SD大鼠260只，体重(250±30) g，随机分成26组，每组10只，自腹腔注射10%水合氯醛(0.35 g/kg体重)麻醉后，将大鼠固定于江湾Ⅱ型脑立体定向仪上，剪毛、消毒，切开头皮、冠状缝后矢状缝旁左右各钻1个直径5 mm的圆形骨窗，硬脑膜完整，采用改良的Feeney等自由落体击伤模型［2］造成左顶叶局限性脑挫裂伤。分别于伤后不同时间点断头采集脑标本。脑损伤+AP5组于伤前30 min经右侧脑室注射AP5(2 mmol/L/ACSF)5 μL，侧脑室注射部位位于前囟右0.8 mm,后1.5 mm，自硬脑膜进针4 mm，轻轻回抽出脑脊液即可确定；脑损伤+ACSF组伤前30 min经侧脑室注射ACSF 5 μL。正常组不作任何处理；假手术组仅开窗不致伤，术后24 h处死。
三、伤侧皮质含水量及NMDA受体活性测定：
动物断头处死后，取出全脑，仔细去除凝血块及破碎坏死组织，自损伤区后缘取皮质1块约(100±10) mg，用电子分析天平测脑皮质湿重，然后放于110℃烤箱烘烤24 h至恒重，取出称干重，用干湿法计算其含水量。
取伤侧余下大脑皮质，置于冰冷的离心缓冲液中，匀浆后低速离心(600 g, 4℃)5 min，取上清再次离心(1 500×g, 4℃)10 min，取上清于37℃水浴中孵化30 min，然后高速离心(4 800×g,4℃)15 min，去上清，用孵育缓冲液充分混悬沉淀，以考马斯亮兰法测膜受体蛋白浓度，并作改进测NMDA受体活性，总结合管和非特异结合管分别加膜蛋白50 μL，与终浓度分别为4、8、12、16、20、24、28、32 nmol/L的［3H］-Glu 50 μL混匀，非特异管内加CPP(终浓度为100 mmol/L) 50 μL,两组均用 ACSF补足使其终浓度为300 μL。于25℃恒温水浴中反应30 min，冰浴终止其反应，用多头细胞收集仪将膜蛋白收集于玻璃纤维滤纸上，80℃烤干1 h，置闪烁仪内测其放射比活性。
四、统计方法：
按Schachard公式对所得数据进行处理，求出Bmax(单位fmol/mg蛋白)和KD(单位nmol/L)，用F检验进行统计分析。
结果
1.随着反应管中放射配基浓度的递增，受体与配基的结合也逐渐增加，当放射配基浓度达一定量时，受体与配基的结合即达饱和，根据饱和曲线按Schachard公式即可求出Bmax和KD。
2.脑损伤后伤侧大脑皮质含水量于30 min高于正常组，6～24 h最明显，之后逐步下降，伤后168 h与正常组比较差异不显著；脑损伤+AP5组于伤后30 min伤侧皮质水含量明显低于损伤组但明显高于正常组(见表1)。
表1 大鼠大脑损伤后伤侧大脑皮质含水量变
Tab 1 Changes of injured cortex water contents after
brain injury in rats (,n=10)
Group Injured cortex water contents(%)
Normal control 79.46±0.53
Sham control 79.67±0.82
Brain injury
Postinjured(h) 0.25 79.66±0.82
0.5 80.06±0.63*
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