|
离子注入对微生物细胞的刻蚀与对DNA的损伤及修复 |
| |
生物学，已证明注入细胞内的低能重离子对农作物和微生物具有良好的诱变效应〔3〕，这说明低能注入离子也具有其它电离辐射能导致DNA损伤的功效。离子注入对生物体的作用是集能量沉积、动量传递、质量沉积和电荷的中和与交换于一体的联合作用〔4〕，因此它与其它电离辐射在作用机理上存在着许多差异，这就决定了离子注入条件下损伤DNA的修复也不同于其它电离辐射, 那么离子注入条件下损伤DNA的修复变化到底是怎样的 为探讨这一问题，本文以D. radiodurans 为试材，以E. coli 为对照，用SEM和3H-TdR标记，研究了N+注入对细胞的刻蚀与对DNA损伤及其修复。
1 材料和方法
1.1 供试菌种和培养方法
D. radioduransAS1.633购于中科院微生物研究所。该菌生长于TGY（胰蛋白胨10g，葡萄糖1g，酵母膏5g，蒸馏水1 000ml）培养基上，生长温度32℃，pH6.8～7.2；E. coliB生长于LB培养基上（胰蛋白胨10g，NaCl 10g，酵母膏5g，蒸馏水1 000 ml）, 生长温度37℃，pH7.0，固体培养时加1.5%的琼脂，两菌在摇床培养时200r/min下良好生长。
1.2 用于扫描显微电镜（SEM）观察的样品制备
取摇瓶培养18h的D. radiodurans （约含3×108CFU/ml）和14h的E. coli （约含2×109CFU/ml）, 用无菌水洗3次，适当稀释（10-4）后取5μl均匀涂布于无菌的玻片上，自然风干表面水分后进行离子注入，对被注入细胞的损伤进行SEM观察。
1.3 细胞的标记与培养
取培养到对数生长期的细胞悬液1ml（约3×108cell/ml）加入TGY培养基中，再加入3H-TdR (20μci/ml) 培养18h →0 ℃ 10 000r/min离心收集细胞→用10-2 mol/L 、pH7.6 的Tris-HCl (含10-3mol/L 的MgCl2) 洗3次→再将细胞悬于此缓冲液中→取此细胞悬液涂玻片→进行N+注入→将注入后的玻片放入含有TGY培养基的摇瓶中，34℃、200 r/min摇洗培养→间隔0，(0时再取样加入200μg/ml 的氯霉素培养4h), 2h、4h、6h取样→离心收集细胞→用Tris-HCl缓冲液洗2次，再将细胞悬于此缓冲液中，并达到106cell/ml→贮于0℃冰箱中备用。
1.4 离子注入处理方法
参考1.2的制样进行离子注入（能量为20keV, 剂量为0～100×1014ions/cm2），注入靶室真空度10-3Pa, 脉冲剂量1014ions/cm2.s, 每次连续注入5s，间隔50～90s, 以消除大剂量下热效应。
1.5 蔗糖梯度密度离心与样品的收集
用简易梯度混合仪制成5～20%蔗糖梯度密度液，沿管壁缓缓注入离心管中，每管4.5ml, 液面上再轻轻加入0.5ml经37 ℃ 用溶菌酶（2mg/ml）温育30min的细胞悬液, 然后35 000r/min离心80min。之后分部收集样品，每0.25ml 为一级, 共20 级分。以上操作均是在无菌条件下进行的。
1.6 cpm数测定
每级分样品加入8ml 闪烁液（含0.5%Butyl-PBD 的二甲苯）和5ml的无水乙醇，使终混合液呈完全无色透明状，再用液闪计数器测定cpm数。
2 结果与分析
2.1 N+注入对微生物细胞的直接作用观察
研究表明，离子注入会导致对细胞的刻蚀作用〔5〕, 图1是1016ion/cm2的N+注入对D. radiodurans 和E. coli 细胞作用的SEM照片。从其表面的形貌显微观察可见，大注入剂量下，细胞受到由表及里的刻蚀损伤，尤其是E. coli 细胞表面多处严重受损，这一结果否定了低能离子注入对细胞的损伤不存在直接作用的论断，充分证实了动量传递对细胞所致的刻蚀作用不仅伤及细胞的壁和膜，而且较大剂量下离子注入的直接作用能象手术刀一样通过持续不断地刻蚀, 形成瞬间的微孔或洞，并深入到细胞内部损伤细胞质和遗传物质DNA。
上一页 [1] [2]
上一个医学论文： 小麦蛋白质组分含量的配合力和遗传力分析
下一个医学论文： 肾缺血预处理增强心脏的电稳定性
|
|
|
|
|
|
|
您现在的位置： 绿色健康网 >> 医学论文 >> 基础医学论文 >> 正文