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一种简便 快速的大肠杆菌质粒转化方法 |
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。取菌液1ml，冰浴10min，4℃12 000 r/min离心20～30 s收集菌体，弃上清，重悬于1ml经预冷的100 mmol/L CaCl2中，冰浴20～40 min，4℃12 000 r/min离心20～30 s收集菌体，弃上清，重悬于0.2ml经预冷的100 mmol/L CaCl2中，冰浴2～7 h；(2) 转化：将10 μl质粒DNA（1ng/μl）与200 μl感受态细胞溶液混匀，经冰浴20～40 min、42℃水浴3～4 min、冰浴1～2 min处理后，加等体积2倍LB培养液，37℃水浴温育1h；(3) 转化子的检测：涂布20 μl转化混合物于加相关抗生素的LB选择平板，37℃倒置培养约20 h，筛选转化子。
平板转化法：挑取受体菌单菌落接种于5ml LB培养液，37℃培养过夜，以1/100量接种于LB培养基活化2～3 h（OD6000.5～0.55），取菌液1ml，12 000 r/min离心20～30 s收集菌体，重悬于200 μl LB培养液，加入10 μl质粒DNA（1ng/μl），混匀，取20 μl转化混合物涂布于4℃下预冷的含Ca2+和相关抗生素的选择平板，37℃倒置培养约20 h，筛选转化子。
2 结果与分析
2.1 平板法与传统的CaCl2处理方法的转化效率
将质粒pBR322分别用二种方法转化经常用的三种大肠杆菌受体菌株TG1，HB101和DH5α，结果（表1）显示，新方法所能达到的转化效率与传统方法相当，可达105转化子/μgDNA，足以满足一般常规克隆的需要。为了进一步证实新方法的适用性，我们又将不同的质粒分别转化同一受体菌。这些质粒包括松弛型质粒pBR322，带有古细菌启动子的重组质粒pJH，以及穿梭质粒pBE2。表2显示用TG1为受体的转化效率比较，其结果表明新方法对所用的三种质粒均显示出与传统方法相当的转化效率，以其它菌株为受体也获得类似的结果，说明该方法具有很好的适用性。表1及表2中的数据均为3次独立实验结果的平均值。
表1 二种转化方法对不同受体菌株的转化效率比较
菌株 传统方法的转化效率
（平均转化子数／ugDNA） 平板转化法的转化效率
（平均转化子数/ugDNA）
TG1 5.1×105 1.84×105
HB101 4.3×105 2.1×105
DH5α 1.8×105 0.89×105
表2 二种转化方法对不同质粒DNA的转化效率比较
质粒 传统方法的转化效率
（平均转化子数／ugDNA） 平板转化法的转化效率
（平均转化子数/ugDNA）
pBR322 5.1×105 1.84×105
pJH 4.6×105 1.9×105
pBE2 0.94×105 1.0×105
2.2 转化子的检测
任意挑取34个用新方法转化所得到的转化子进行质粒检测，均能检测到质粒，而且酶切结果（图1）也显示，不同转化子所携带质粒的大小及酶切位点均完全与原转化质粒DNA相同，说明所采用的平板转化方法具有与传统转化方法相同的质粒转化特点〔13〕。此外，用从转化子中提取的质粒，采用新方法重新转化受体菌，仍可以获得相似的转化结果，说明采用新方法对质粒的转化活性也无影响。
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