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应用包埋前免疫胶体金直接法研究细胞内病毒抗原超微定位 |
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度测定 取50 μl SPA(1 mg/0.2 ml)加入硅化的1.5 ml Ep管中用0.005 mol/L NaCl进行倍比稀释，各管加入250 μl胶体金液(pH 6)混匀后再加入250 μl 10% NaCl，用胶体金颜色由红变蓝的EP管的SPA量，计算出稳定1 ml 5 nm胶体需SPA 6 μg。
1.6.2 SPA胶体金复合物的纯化及鉴定 按上述最适浓度将SPA与胶体金混合，加入1%聚乙二醇2000(PEG-2000)使其最终浓度为0.05%，60 000 r/min, 4℃，离心1 h，于透射电镜下摄片鉴定其大小均一性。
1.7 包埋前胶体金标记细胞内抗原的电镜观察 HSV-1 SM44感染HEL细胞12 h，细胞病变至++，用PBS洗3次，橡皮帚刮下细胞，1 500 r/min，离心10 min，细胞沉淀悬浮于0.5 ml 1%多聚甲醛、0.002%皂素、0.025%戊二醛混合液中，4℃ 1 h，PBS洗3次，加1：40稀释的HSV-1阳性血清。室温1 h，PBS洗3次，加1：80稀释的SPA胶体金复合物，室温
1 h，PBS洗3次后，常规锇酸固定、乙醇脱水、包埋、切片用于透射电镜观察，用阴性血清代替阳性血清作阴性对照。
2 结果
2.1 SPA胶体金均一性及大小鉴定 在电镜下见SPA胶体金呈圆形，单个分散，电子密度高、致密。金颗粒大小基本一致，其直径平均为(5.04±1.14) nm(图1)。
2.2 SPA胶体金直接法标记HSV-1电镜观察 电镜下见HEL细胞膜结构完整，细胞浆中病毒囊膜及其邻近的内质网膜上的病毒抗原结合，在未成熟的病毒囊膜上也有大量的金颗粒，他们的外周区域可见大量的金颗粒聚集(图2)。阴性对照电镜下可见细胞膜结构完整，细胞核内有大量未成熟的HSV-1颗粒。细胞浆内有大量成熟的病毒颗粒，但其囊膜上无特异性结合的金颗粒。少量金颗粒透入细胞浆及细胞核内呈随机散在游离性分布(图3)。
图1 5 nm SPA胶体金电镜观察
Fig.1 Electronic microscopy of 5 nm SPA-immunogold
图2 SPA胶体金标记HSV-1抗原免疫电镜
Fig.2 The immunoelectronic microscopy of SPA-gold labelled HSV-1 antigens
Note:a. the SPA-gold particles conjugatied with the envelope of mature HSV-1；b. the SPA-gold particles conjugated with the envelope of immature HSV-1;c. the SPA-gold particles existed in the membrance of endoplasmic reticulum;d. the areas congregated with SPA-gold particles
图3 阴性对照免疫电镜
Fig.3 The immunoelectronic microscopy of negative control
Note:a.immature HSV-1 in nucleus b.mature HSV-1 in cytoplasm c.the scattering free gold particles
3 讨论
自Faulk等建立胶体金免疫电镜技术以来，该方法广泛地应用于细胞内分泌蛋白、多肽、膜结构蛋白、胞浆蛋白等抗原的超微定位研究［2-6］，但用于病毒抗原的研究鲜有报道。上述研究多用包埋后免疫金标记的方法，该方法有非特异性金颗粒较多的不足。我们用皂素处理HEL细胞，在包埋前用自己制备的5 nm SPA胶体金成功地标记了HSV-1抗原，电镜下可清楚地显示HSV-1在形态发生过程中抗原在细胞内的分布，其分布的部位与HSV-1在核内复制，由核膜芽生，经内质网输送至胞浆。成熟释放于胞外的增殖过程及与HSV-1结构蛋白抗原的分布相符。
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