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缺氧及烧伤大鼠血清对培养的乳鼠细胞间隙连接通讯的影响 |
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王旭 迟路湘 吴军 杨宗城
细胞间隙连接通讯(GJIC)是一种近距离的细胞间通讯方式，主要传递组织或细胞群体内基因信号，对细胞的正常增殖、分化和代谢功能以及组织自身稳定等起着重要调节作用。我们利用划痕标记染料示踪技术和扫描电镜，观察培养乳鼠心肌细胞在缺氧、烧伤血清刺激下的早期动态变化。
材料与方法
1.乳鼠心肌细胞培养及实验分组：出生48 h以内的乳鼠，剥离心包膜，留心尖部剪碎，加入常规消化液37 ℃ 10 min，以1×108／L的密度种植，5% CO2培养箱常规培养。
心肌细胞培养1周，待单层细胞覆盖密度趋于饱和时进行致伤。(1)对照组：心肌细胞常规培养7 d，于1 h\,3 h\,6 h收集标本；(2)单纯缺氧组：细胞培养7 d，将5% CO2改换成92%
国家自然科学基金重大项目(39290700-03)
N2，4% O2，4% CO2混合气体充入培养皿中，模拟缺氧环境，致伤后1 h\,3h\,6 h收集标本；(3)单纯烧伤血清组：细胞培养7 d，吸除培养液，改加含10%大鼠烧伤血清DMEM培养液(30%体表面积Ⅲ度烧伤后48 h内血清)，致伤后1 h\,3 h\,6 h收集标本；(4)双因素致伤组：将常规培养至第7 d的心肌细胞，改换含10%大鼠烧伤血清DMEM培养液，充入混合气取代有氧培养，于伤后1 h\,3 h\,6 h收集标本进行检测。
2.划痕标记染料示踪技术(SLDT)检测DJIC：致伤结束时吸除培养液，PBS液(pH 7.2)冲洗3次，用手术刀在盖玻片上轻轻划痕数条，相距约2 mm，将含有0.05 % Lucifer-yellow(LY, Sigma产品)的PBS溶液2 mL加入平皿3 min。吸净荧光染料，PBS漂洗2次，欧林巴斯荧光显微镜下观察，照像。
3.扫描电镜：将致伤后的心肌细胞用2.5%戊二醛固定24 h，1%锇酸后固定1 h，乙醇系列脱水，醋酸异戊酯置换，临界点干燥，离子喷镀后在JSM-T 300型扫描电镜下观察并摄片。
结果
1.心肌细胞培养：单细胞种植20 h，部分细胞贴壁伸展，有多个细而长的触突，博动明显但频率不一，5～7 d后单层细胞覆盖整个玻片，相近细胞博动频率逐渐一致。
2.致伤后心肌细胞GJIC功能的变化：正常乳鼠心肌细胞培养后具有细胞间隙连接通讯功能，LY荧光染料传递划痕标记附近5例细胞。由划痕处即染料传输前沿，荧光染料浓度由近及远逐渐因消耗而降低，荧光强度逐渐减弱。未划痕区细胞无荧光标记现象。
实验组心肌细胞在致伤后1 h，即表现出GJIC功能传导阻滞，着色细胞与划痕线之间距离缩短，呈点状横向排列。随致伤时间延长，荧光染料停滞在划痕边沿不再扩展，提示心肌GJIC功能受到抑制(表1)。
表1 心肌细胞致伤后GJIC功能的变化
Tab 1 Effect of hypoxia, burnt serum on gap junctional intercellular communication in cultured cardiomyocytes
Time
(postburn) Control Hypoxia Burnt
serum Hypoxia and
burnt serum
1 h +++ ++ +++ +
3 h +++ + ++ -
6 h +++ - + -
“-”:The LY fluorescence was limited to the primary loades cell
“+～+++”：Transfer of LY fluorescence reached some rows of cells from the scraped line;LY=Lucifer-yellow
3.扫描电镜下心肌细胞的形态学改变：正常心肌细胞呈梭形、柱状或多角形，多伪足，彼此连接紧密。细胞边缘微绒毛丰富，细胞表面微嵴分布均一，密度中等。致伤后，心肌细胞表面微嵴分布紊乱，有嵴消失小区或微嵴致密。细胞膜边缘变厚，细胞伪足和微绒毛减少或断裂，细胞间彼此分离，呈脱落前征象，尤以缺氧复合烧伤血清组最为明显。
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