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心肌线粒体肌酸激酶肌膜型亚基基因在大肠杆菌中的表达 |
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；C.before temperature induction；D， E. 4 hours after temperature induction
图4 sMiMi-CK基因表达产物的SDS-PAGE分析
3.诱导蛋白表达量的测定：诱导的sMiMi-CK蛋白得到了高效表达，其电泳凝胶经密度扫描仪分析，sMiMi-CK蛋白表达量占大肠杆菌总蛋白的10.7%。
4.表达蛋白质的活性测定：用含7 mol/L盐酸胍50 mmol/L Tris-HCl溶液(pH 8.0)裂解细胞，在生化自动分析仪上测活性，得到活性为2.74×105 IU/L菌液。
讨论
利用大肠杆菌(E.coli)来合成某些生物分子，具有低成本、高效率、周期短等特点，已越来越成为人们研究的热门领域。但是，在利用E.coli表达外源基因的过程中，往往会遇到许多困难，使表达效率难以得到最大限度的提高，因而影响了产率［4］。
我们采用DNA重组技术构建了PBV 220-sMiMi-CK表达质粒，表达了sMiMi-CK非融合蛋白，扫描分析结果证明表达量占大肠杆菌总蛋白的10.7%，并测得其活性为2.74×105 IU/L菌液，表明真正获得了sMiMi-CK蛋白质。
随着生物技术的发展，基因工程已经开始与医药生产、疾病的治疗有了紧密的结合，基因治疗则是近几年刚刚起步，比较吸引人的课题。有文献报道［5］，心功能衰竭，心肌肥大时，肌酸激酶活性下降，我们以前的实验结果为缺血/再灌注时，sMiMi-CK表达减少，从而推测其活性下降，这为能量代谢障碍，如心衰、心肌肥大，尤其是缺血性心脏病的基因治疗开辟了一条新路，前景为：(1)可以直接应用廉价的sMiMi-CK基因在体外的表达产物来增加体内sMiMi-CK的量，进而改善线粒体内能量代谢障碍，保护心肌细胞减轻或避免心肌缺血/再灌注损伤；(2)可将重组该基因的真核表达载体经纯化后，输入体内，使其在体内产生sMiMi-CK，以补充sMiMi-CK的数量，从而改善心肌缺血/再灌注损伤。
* 黑龙江省自然科学基金资助：D09613
作者单位:李 芳 朱世军 王孝铭 孙明智 哈尔滨医科大学病理生理教研室(哈尔滨150086)
于康振 陈化南 兽医生物技术国家重点实验室
参考文献
1 张 桦，王孝铭，刘树森.能量转换障碍与心肌缺血再灌注损伤——呼吸链电子传递与质子的变化.中国病理生理杂志，1991，7：157.
2 Robert C, Cllfford K, Zhifang Z, et al. Isolation and characterization of the gene and cDNA encoding human mitochondrial creatine kinase. J Biol Chem, 1989, 264:2890.
3 Mark R, Robert C, Arnold W, et al. Structural characterization and tissue-specific expression of the mRNA encoding isoenzymes from two rat mitochondrial creatine kinase gene. Biochim Biphys Acta, 1991, 1089:352.
4 张智清，姚立江，候云德.含PRPL启动子的原核高效表达载体的组建及其应用.病毒学报，1990，6：11.
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