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心肌线粒体肌酸激酶肌膜型亚基基因在大肠杆菌中的表达 |
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李 芳 朱世军 于康振 王孝铭 陈化南 孙明智
随着临床冠状动脉旁路术、经皮冠状动脉成形术以及溶栓术的应用，虽然挽救了许多心肌缺血性疾病患者的生命，但是也应运而出现了“再灌注损伤”问题。目前，人们认识到能量代谢障碍是造成心肌再灌注后细胞及亚细胞损伤的重要始动因素［1］，而心肌线粒体肌酸激酶与能量代谢密切相关，它位于线粒体内外膜之间，内膜外表面上，是线粒体ATP的产生、利用、转换和贮存的关键酶［2］。其中线粒体肌酸激酶肌膜型亚基(sMiMi-CK)只存在于心肌线粒体中，并能高效表达［3］。故我们以此为重点在体外表达sMiMi-CK，从而为缺血性心脏病的治疗开辟一条基因治疗的新途径。
材料与方法
1.质粒和菌株：受体菌DH5α和表达载体PBV220均由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所国家生物技术重点实验室提供。
2.试剂：限制性内切酶系购自华美公司，T4DNA Ligase购自Promega公司。
3.重组表达质粒PBV 220的构建：用组建的已测序的PUC 19重组子，经EcoRⅠ、Hind Ⅲ酶切后，获得sMiMi-CK cDNA片段，将该片段补平，经T4DNA Ligase连接构建重组子PBV 220，转化入感受态大肠杆菌DH5α中，提取重组质粒用限制性内切酶图谱分析筛选获得方向插入正确的重组菌。
4.目的基因的诱导表达：将重组质粒sMiMi-CK及质粒载体PBV 220分别转化到感受态的DH5α中，经37℃活化过夜后，1∶100稀释到LB培养液中，继续在37℃摇床培养至OD=0.2～0.6，迅速转到42℃摇床培养4～6 h，收集菌体，进行SDS-PAGE和凝胶密度扫描分析测定蛋白含量。
5.表达产物活性的测定：收集的菌体用7 mol/L盐酸胍-50 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)裂解，然后以17 000 r/min离心15 min，弃沉淀，用NADPH紫外分光光度法在生化自动分析仪上检测sMiMi-CK活性。
结果
1.重组表达质粒的构建：将已鉴定测序的sMiMi-CK基因与表达载体PBV 220进行平端连接，得到重组质粒，电泳大小见图1，用EcoRⅠ、Sal Ⅰ进行酶切，得到外源基因1.33 kb和表达载体3.69 kb的片段，见图2。再用BaH Ⅰ酶切，得到3.7 kb，1.1 kb及0.2 kb左右的带，证明sMiMi-CK基因在重组质粒中为正向连接，见图3。
Fig 1 Analysis of recombinant plasmid by single enzyme digestion
A. λDNA/Hind Ⅲ Marker；B. PBV 220-sMiMi-CK/EcoR Ⅰ；C. PBV 220-sMiMi-CK/Sal Ⅰ；D. PBV 220-sMiMi-CK/Cla Ⅰ
图1 重组质粒的单酶切鉴定
Fig 2 Analysis of recombinant plasmid by double enzyme digestion；A. λDNA/Hind Ⅲ Marker；B.PBV 220-sMiMi-CK/EcoRⅠ+Sal Ⅰ
图2 重组质粒的双酶切鉴定
Fig 3 Identification of pBV 220-sMiMi-CK insert direction by BamH Ⅰ digestion
A.λDNA/Hind Ⅲ Marker；B.PBV 220-sMiMi-CK/BamH Ⅰ
图3 sMiMi-CK基因插入方向的判定
2.sMiMi-CK基因蛋白的诱导：将含有sMiMi-CK基因的表达载体PBV 220，经温度诱导后培养，收集菌体裂解，进行SDS-PAGE电泳，结果见图4，未诱导的菌体中没有sMiMi-CK的表达，而诱导的菌体中有明显的sMiMi-CK的蛋白带，分子量约为45.8×103左右。
Fig 4 Analysis of expression products by SDS-PAGE
A. molecular weight standards；B.plasmid PBV220[1] [2] 下一页
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