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心肌细胞分离术 |
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pH=7.4）洗2次。再以4.656～5.320 kPa压力（7～8 mL/min)经主动脉 灌注心脏5 min。 用50 mL胶原酶液-1 ［collagenase Ⅱ 0.43 mg/mL(273 U/mg), hyaluronidase 0.3 mg/mL,溶于无Ca2+ K-H液中］循环灌注心脏20 min。3 min后压力渐升至7.980～9.310 kPa,然后又降至5.985 kPa左右。用酶液-2（trypsin 2 mg/mL,DNase 0.2 mg/mL溶于酶液-1 中）20 mL循环灌流 10 min。取下心脏, 在含0.2% BSA, 0.3 mmoL/L Ca2+的K-H液中剪去心房及右心室。将左心室剪成数片，用针头轻轻划碎后洗3次。10～15 min后,弃上清,用5 mL含0.6 mmol/L Ca2+的K-H液洗沉降之细胞。10 min后再用含1.0 mmol/L Ca2+的K-H液洗细胞, 此时细胞鲜红。第2管细胞收缩功能最好，杆形细胞率在90%以上。此细胞可连续跳动4～8 h 。
三、狗心肌细胞分离术［2］：
1. 狗经苯巴比妥钠 30 mg/kg iv麻醉,1 000 U/mL肝素10 mL iv。气管插管，人工呼吸，开胸取出心脏。置于4℃无钙K-H液中，剪去心房及右心室。 在左右心交界右侧旁开 1 cm 纵行剪开室间隔及主动脉。在主动脉根部找到冠状动脉入口。沿冠状动脉前降支或左旋支两侧剪下宽长3 cm×6 cm心肌组织。用16 G针头外套胶管连三通及60 mL注射器插入冠状动脉 1.5 cm。用2号针线缝扎固定胶管。用温无Ca2+ K-H液经三通冲洗心肌组织。用3号针线缝扎心肌周边血管， 使组织各部位毛细血管灌流充分,此步关键。
2.用无Ca2+ K-H液灌注(12～15 mL/min) 5 min。此时压力在1.995～2.349 kPa。 用酶液-1(collagenase Ⅱ 0.57 mg/mL,溶于无Ca2+ K-H液中）240 mL循环消化20～ 22 min。消化开始后3 min 压力渐上升至6.650～7.980 kPa, 有时可达10.64～13.30 kPa。如果压力上升不超过 2.660 kPa,说明缝扎有误,毛细血管灌流很差,多导致失败。22 min后压力不一定能降到3.990～5.320 kPa，此时心肌肿胀,触之有紧张感。于心肌块中部靠远端由内膜向取组织2 cm×2 cm×2 cm。在酶液-2中剪碎。于50 mL试管中, 用20 mL酶液-2( 2.5 % BSA, 0.3 mmol/L Ca2+, Collagenase Ⅱ 0.23 mg/mL, 溶于无Ca2+ K-H液）,于37 ℃, 温浴消化5 min,充95% O2+5% CO2。取上层悬液,于另一试管中, 1 000 r/min离心1 min。弃上清,用 20 mL含1%BSA,0.6 mmol/L Ca2+的K-H液洗细胞。酶液2消化洗脱细胞重复4次。 10 min后,各管弃上清,加入15 mL含1.0 mmol/L Ca2+的K-H液。
四、羊及人心肌细胞的分离：
分离程序与狗的基本相同。用酶液-1(collagenase Ⅰ 0.5 mg/mL, collagenase Ⅱ 0.27 mg/mL, BSA 0.1%, 小牛血清 0.015%)消化时间为28～30 min。压力可从开始的 1.995～2.660 kPa上升至6.650～7.890 kPa, 然后下降至3.990～4.655 kPa。再用酶液-2(collagenaseⅠ0.2 mg/mL,collagenase Ⅱ 0.11 mg/mL, BSA 2.5%, CaCl2 0.3 mmol/L) 消化10 min。羊或人的心肌组织较狗的脆弱，缝扎及消化的度不易掌握,尤其在缺血梗塞较重或取材后滞留较久的组织。
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