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心肌细胞分离术 |
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陈吉球
心肌细胞分离方法在不断得到改进。根据实验目的的不同，不断调整分离程序及方法［1～3］。但要得到高产量，有持久（＞2 h）兴奋性和收缩功能的心肌细胞，仍不是一件容易的事［3］，尤其是我们在整体或离体心脏复制各种疾病模型（缺血，心肌肥大等），要在单心肌细胞功能方面研究其病理生理机制时。胶原 酶消化分离出的心肌细胞在产量及活力方面受胶原酶, 缓冲液成分,pH,温度,灌流量及消化时间的影响［3，4］。 胶原酶液对心肌组织的灌流量及时间比较不易掌握, 从而影响心肌细胞的产量及收缩功能。胶原酶液灌流量及消化时间视动物种属，心脏大小而不同。用什么来比较客观地反映灌注及消化的度量，从而得到功能稳定，重复性好的心肌细胞，这方面的报道不多。本人根据在美国Allegheny大学Dr. Vatner实验室工作的经验,总结分离小鼠,大鼠,兔子,狗，羊及人心肌细胞的方法, 供读者参考。
一、成年小鼠心肌细胞的分离［3］：
1. Langendorff 装置的改进（图1）。 如图1所示，用灌流泵将缓冲液泵入保温杯中，通过三通 2 调节保温杯内液面，过高浪费酶液，过低则易进入空气。在流出道外口装压力换能器，经显示器监测压力变化。通过灌流泵的流速，调节基础压力的大小。
Fig 1 Amelioration of Langendorff perfution system.
1.Glass jacked container;2.stopcut; 3.transducer; 4.manometer; 5.heart; 6.95%O2+5%CO2;7. thermostat; 8.thermostatic water bath; 9.buffer solution; 10.pump
图1 Langendorff装置的改进
2. 小鼠 (2～6 月. 25～35 g), 肝素5 000 U/kg ip 。 20 min 后颈关节脱位处死。开胸取出心脏,于无Ca2+台氏液(mmol/L) NaCl 132, KCl 4.8, Glucose 5, MgCl2 6， H2O 1.2, HEPEs 10,pH=7.4)中清洗两次。剪去肺残叶及脂肪。主动脉逆行插管，用 37℃无Ca2+台氏液灌5 min,流量2～3 mL/min, 压力应为3.990～5.054 kPa。通过台氏液连续给95% O2+5% CO2混合气体。
3. 用胶原酶液［collagenase Ⅰ 0.5 mg/mL(148 U/mg),collagenase Ⅱ 0.27 mg/mL(273 U/mg, Worthington)］,牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA 0.1%), 小牛血清(calf serum 0.015%） 40 mL灌流17～19 min(慢性缺氧小鼠约13～15 min, 年老或转基因心衰鼠19～21 min)。 若灌流得好, 心脏鲜红稍带黄， 若有黄白斑点,说明有栓塞。酶液进入心脏2 min后压力开始上升,5～7 min渐升至6.650～7.980 kPa。然后渐下降，约18 min降至3.72 kPa，此时心脏松软鲜红，即取下心脏。若压力尚高于3.990 kPa，表示消化不足，产量会较低。若时间过长，压力低于3.325 kPa,细胞将明显受损，出现不规则自律收缩，功能下降。
4.取下心脏于含0.1% BSA,0.015%小牛血清的台氏液中剪去心房及右心室。用针头将左心室肌划碎,移于10 mL试管中。先吸悬液移至另一试管。再加上液,用吸管轻轻冲吸, 使小块组织变为细胞悬液,移至另一试管。再洗1次得第3管。剩下少量网状结缔组织,弃之。10 min 后细胞自然沉降,去上清。用5 mL含0.4 mmol/L Ca2+的台氏液轻轻冲洗。再隔10 min去上清,加入5 mL含0.8 mmol/L Ca2+的台氏液。第2管细胞最好。杆形有收缩功能细胞可达60%～75%。室温(22～23℃)下记录细胞收缩功能。此细胞可连续跳动2～4 h 。
二、成年大鼠心肌细胞分离术［5］：
大鼠经苯巴比妥钠30 mg/kg ip麻醉,1 000 U/mL肝素0.3～0.4 mL iv。开胸取心脏,用37 ℃无Ca2+K-H液(mmol/L)NaCl 130, KCl 4.8,MgSO4 1.2,NaHCO3 2.5, NaH2PO4- H2O 1.2, Glucose 12.5, HEPEs 12, [1] [2] 下一页
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